Бесклеточная ДНК обнаруживается в отработанной культуральной среде эмбрионов и считается потенциальным маркером для их оценки. Это открывает большие возможности неинвазивного ПГТ-А (ниПГТ-А). Сбор культуральной среды не требует ни высококвалифицированного персонала, ни дорогостоящего оборудования, что делает ниПГТ-А более доступным для лабораторий ЭКО.
В нескольких исследованиях сравнивались результаты ниПГТ-А с биопсией трофэктодермы витрифицированных эмбрионов и сообщалось о высокой степени амплификации в диапазоне от 80,4 до 100% и степени конкордантности до 93,8% . Однако сообщалось о ложноотрицательных результатах, которые были связаны с загрязнением материнскими клетками. Необходимо крупное многоцентровое рандомизированное исследование для подтверждения эффективности ниПГТ-А с точки зрения частоты родов и выкидышей. Оптимизация протокола ниПГТ-А имеет важное значение до начала клинического исследования.
Цель: оптимизация ниПГТ-А в лаборатории путем сравнения двух сроков сбора отработанной культуральной среды, двух протоколов промывания эмбрионов и использования оплодотворение методом ЭКО вместо ИКСИ.
Материалы и методы
В это исследование были включены женщины, прошедшие цикл ЭКО в одном из 3-х центов в период с февраля 2020 года по март 2021 года. Все женщины согласились пожертвовать использованные культуральные среды и непригодные для использования эмбрионы для исследования.
Сравнение методов промывания эмбрионов
В исследовании сравнивались два метода промывания эмбрионов: одноэтапное и последовательное. Метод одноэтапного промывания (n = 65) включал промывание эмбрионов в капле культуры G-TL объемом 500 мкл на третий день перед переносом в свежую микрокапельку для дальнейшего культивирования. При методе последовательного промывания (n = 88) эмбрионы в группе промывали пятью культуральными каплями G-TL по 500 мкл перед переносом в микрокапле свежей культуры для культивирования до 5 или 6 дня. Результаты культуральной среды сравнивали с биопсией трофэктодермы. Мозаичная анеуплоидия не упоминалась в исследовании, поскольку набор NI-PGT не был проверен на предмет выявления мозаицизма.
НиПГТ-А
Чтобы проанализировать надежность культуральной среды, было исследовано соответствие между биопсией трофэктодермы и культуральной среды с точки зрения обнаружения анеуплоидии. Образцы с результатами были разделены на 4 категории.
1) Полное соответствие: оба образца имели анеуплоидию по одним и тем же хромосомам или оба образца были эуплоидными.
2) Полное соответствие: оба образца были анеуплоидными с одним из следующих наблюдений:
а. результаты были дополняющими друг друга с точки зрения прироста или утраты одной и той же хромосомы (анеуплоидия-комплементарность)
б. такая же анеуплоидия была обнаружена хотя бы на одной хромосоме
в. анеуплоидии обнаруживаются на совершенно разных хромосомах
3) Дискордантность: один образец был анеуплоидным, а другой — эуплоидным.
4) Неинформативный результат.
Результаты
- Чтобы определить степень загрязнение материнской ДНК в культуральной среде, авторы проанализировали 11 пар культуральных сред, собранных на 3-й и 6-й день , полученных в результате оплодотворения ЭКО. Результаты ниПГТ-А сравнивали с результатами ПГТ-А соответствующих целых эмбрионов. Конкордантность изменилась с 22,2% (2/9) на 3-й день до 66,7% (6/9) в образцах на 6-й день после одноэтапной промывки. Фактически, 9 из 11 эмбрионов в этой когорте были мужскими, тогда как все результаты культуральной среды на 3-й день были эуплоидными женскими, что указывает на то, что низкая конкордантность на 3-й день была обусловлена загрязнением материнскими клетками.
- Были проанализированы 153 культуральных сред от 153 эмбрионов, которые культивировали с 3-го дня до дня биопсии (5-й или 6-й день) для ПГТ.
- Степень совпадения была выше при последовательном промывании, чем при методе одноэтапного промывания (75,4% против 68,0%, p = 0,38; соответствие по полу (61,5% против 50,0%, p=0,22). Значительная разница наблюдалась в степени полного соответствия и пола (47,7% против 24,0%, p = 0,0092).
- При использовании последовательного метода промывания степень совпадения была выше в образцах на 6-й день, чем в образцах на 5-й день, с точки зрения общего соответствия (85,0% против 60,0%, p = 0,0228), соответствия пола (82,5% против 28,0%, p < 0,0001) и полной конкордантности и пола (62,5% против 24,0%, p = 0,0025).
- Не было значительной разницы в результатах ниПГТ-А циклов в зависимости от метода оплодовтоврения методом ЭКО и ИКСИ.
Заключение Был продемонстрирован более высокий уровень совпадения при сборе культуральной среды на 6-й день и последовательном промывании эмбрионов. Сопоставимые результаты применения ниПГТ-А при оплодотворении ооцитов путем ЭКО и ИКСИ. Эти шаги по оптимизации важны до начала рандомизированного исследования ниПГТ-А.