Наблюдение за всем, что находится в человеческом мозге, независимо от его размера и состояния, пока он полностью цел, на протяжении десятилетий было недостижимой мечтой нейробиологов, но в новом исследовании, опубликованном в журнале Science, группа из Массачусетского технологического института описывает технологический конвейер, который позволил им точно обрабатывать, снабжать подробной маркировкой и получать четкие изображения целых полушарий мозга двух доноров — одного с болезнью Альцгеймера и одного без нее — с высоким разрешением и скоростью.
«Мы провели целостную визуализацию тканей человеческого мозга в различных разрешениях от отдельных синапсов до целых полушарий мозга, и мы сделали эти данные доступными», — сказал старший и корреспондентский автор Квангун Чунг, доцент Института обучения и памяти Пикауэра, кафедр химической инженерии и мозговых и когнитивных наук, а также Института медицинской инженерии и науки Массачусетского технологического института. «Этот технологический конвейер действительно позволяет нам анализировать человеческий мозг в различных масштабах. Потенциально этот конвейер может быть использован для полного картирования человеческого мозга».
Новое исследование пока не представляет собой всеобъемлющую карту или атлас всего мозга, в котором каждая клетка, цепь и белок идентифицированы и проанализированы, но с полной визуализацией полушарий оно демонстрирует интегрированный набор из трех технологий, чтобы сделать возможными это и другие давно искомые исследования нейронауки. Исследование обеспечивает «доказательство концепции», показывая многочисленные примеры того, что делает возможным конвейер, включая обширные ландшафты тысяч нейронов в целых областях мозга, разнообразные леса клеток, каждая из которых представлена в индивидуальной детализации, и пучки субклеточных структур, расположенных среди внеклеточных молекул. Исследователи также представляют богатое разнообразие количественных аналитических сравнений, сосредоточенных на выбранной области в полушариях с болезнью Альцгеймера и без болезни Альцгеймера.
По словам Чунга, возможность получения изображений целых полушарий человеческого мозга в целости и сохранности вплоть до отдельных синапсов (крошечных связей, которые нейроны создают для создания цепей) имеет двойное значение для понимания человеческого мозга в здоровом и больном состоянии.
С одной стороны, это позволит ученым проводить комплексные исследования вопросов, используя один и тот же мозг, вместо того, чтобы, например, наблюдать различные явления в разных мозгах, которые могут значительно различаться, а затем пытаться построить составную картину всей системы. Ключевой особенностью нового технологического конвейера является то, что анализ не разрушает ткань. Напротив, он делает ткани чрезвычайно прочными и многократно перемаркированными для выделения различных клеток или молекул по мере необходимости для новых исследований в течение многих лет подряд. В статье команда Чанга демонстрирует использование 20 различных меток антител для выделения различных клеток и белков, но они уже расширяют это до сотни и более.
«Нам нужно иметь возможность увидеть все эти различные функциональные компоненты — клетки, их морфологию и их связность, субклеточную архитектуру и их индивидуальные синаптические связи — в идеале в пределах одного и того же мозга, учитывая высокую индивидуальную изменчивость человеческого мозга и учитывая драгоценную природу образцов человеческого мозга», — сказал Чанг. «Этот технологический конвейер действительно позволяет нам извлекать все эти важные особенности из одного и того же мозга полностью интегрированным образом».
С другой стороны, относительно высокая масштабируемость и пропускная способность конвейера (визуализация целого полушария мозга после его подготовки занимает 100 часов, а не много месяцев) означает, что можно создать много образцов для представления разных полов, возрастов, состояний заболевания и других факторов, которые могут обеспечить надежные сравнения с повышенной статистической мощностью. Чанг сказал, что он предполагает создать банк полностью визуализированных мозгов, которые исследователи могли бы анализировать и перемаркировать по мере необходимости для новых исследований, чтобы сделать больше сравнений, которые он и соавторы сделали с полушариями с болезнью Альцгеймера и без нее в новой статье.
Три ключевых нововведения
Чанг сказал, что самой большой проблемой, с которой он столкнулся при достижении описанных в статье достижений, было создание команды в MIT, в которую вошли три особенно талантливых молодых ученых, каждый из которых был соавтором статьи из-за их ключевых ролей в создании трех основных инноваций. Джи Ван, инженер-механик и бывший постдок, разработал «Мегатом», устройство для нарезки целых полушарий человеческого мозга настолько мелко, что они не повреждаются. Джухёк Пак, инженер-материаловед и бывший постдок, разработал химию, которая делает каждый срез мозга прозрачным, гибким, прочным, расширяемым и быстро, равномерно и многократно маркируемым — технология под названием «mELAST». Вебстер Гуан, бывший аспирант факультета химической инженерии Массачусетского технологического института, обладающий талантом к разработке программного обеспечения, создал вычислительную систему под названием «UNSLICE», которая может бесшовно объединять пластины для реконструкции каждого полушария в полном трехмерном пространстве вплоть до точного расположения отдельных кровеносных сосудов и нейронных аксонов (длинных цепей, которые они вытягивают для создания связей с другими нейронами).
Ни одна технология не позволяет визуализировать анатомию человеческого мозга в субклеточном разрешении без предварительного разрезания, поскольку он очень толстый (в 3000 раз больше объема мозга мыши) и непрозрачный. Но в Мегатоме ткань остается неповрежденной, потому что Ван, которая сейчас работает в компании LifeCanvas Technologies, основанной Чунгом, спроектировала его лезвие так, чтобы оно вибрировало из стороны в сторону быстрее и при этом охватывало более широкую область, чем предыдущие вибратомные слайсеры. Между тем, она также спроектировала инструмент так, чтобы он идеально оставался в своей плоскости, сказала Чунг. Результатом являются срезы, которые не теряют анатомическую информацию при их разделении или в другом месте. И поскольку вибратом режет относительно быстро и может резать более толстые (и, следовательно, меньше) пласты ткани, целое полушарие можно разрезать за день, а не за месяцы.
Основная причина, по которой пластины в трубопроводе могут быть толще, исходит от mELAST. Парк разработал гидрогель, который вливается в образец мозга, чтобы сделать его оптически прозрачным, практически неразрушимым, сжимаемым и расширяемым. В сочетании с другими технологиями химической инженерии, разработанными в последние годы в лаборатории Чунга, образцы затем могут быть равномерно и быстро влиты с антителами-метками, которые выделяют интересующие клетки и белки. Используя микроскоп светового листа, настроенный лабораторией, можно получить изображение целого полушария вплоть до отдельных синапсов примерно за 100 часов, сообщают авторы в исследовании. Сейчас Парк является доцентом Сеульского национального университета в Южной Корее. «Эта передовая полимерная сеть, которая точно настраивает физико-химические свойства тканей, позволила проводить мультиплексную многомасштабную визуализацию неповрежденного человеческого мозга», — сказал Парк.
После того, как каждый срез был визуализирован, задача состоит в том, чтобы восстановить неповрежденную картину всего полушария вычислительным путем. UNSLICE Гуана делает это в нескольких масштабах. Например, в среднем, или «мезо» масштабе, он алгоритмически отслеживает кровеносные сосуды, входящие в один слой из соседних слоев, и сопоставляет их. Но он также использует еще более тонкий подход. Для дальнейшей регистрации срезов команда намеренно пометила соседние нейронные аксоны разными цветами (как провода в электроприборе). Это позволило UNSLICE сопоставлять слои на основе отслеживания аксонов, сказал Чунг. Гуан также теперь работает в LifeCanvas.
В исследовании исследователи представляют целую череду примеров того, что может делать конвейер. Самый первый рисунок демонстрирует, что визуализация позволяет богато маркировать целое полушарие, а затем увеличивать масштаб от широкого масштаба мозговых структур до уровня цепей, затем отдельных клеток и затем субклеточных компонентов, таких как синапсы. Другие изображения и видео демонстрируют, насколько разнообразной может быть маркировка, показывая длинные аксональные связи, а также обилие и форму различных типов клеток, включая не только нейроны, но также астроциты и микроглию.
Изучение болезни Альцгеймера
В течение многих лет Чанг сотрудничал с соавтором Мэтью Фрошем, исследователем болезни Альцгеймера и директором банка мозга в Массачусетской больнице общего профиля, чтобы визуализировать и понять мозг при болезни Альцгеймера. С установлением нового трубопровода они начали открытое исследование, сначала отметив, где в пласте ткани они увидели наибольшую потерю нейронов в образце болезни по сравнению с контрольной группой. Оттуда они следовали своему любопытству — насколько позволяла технология — в конечном итоге создав серию подробных исследований, описанных в статье.
«Мы не планировали все эти эксперименты заранее», — сказал Чанг. «Мы просто начали, сказав: «Хорошо, давайте сделаем изображение этой пластины и посмотрим, что мы увидим». Мы определили области мозга со значительной потерей нейронов, так что давайте посмотрим, что там происходит. «Давайте копнем глубже». Поэтому мы использовали много разных маркеров, чтобы охарактеризовать и увидеть взаимосвязи между патогенными факторами и различными типами клеток.
«Этот трубопровод позволяет нам иметь практически неограниченный доступ к тканям», — сказал Чунг. «Мы всегда можем вернуться и посмотреть на что-то новое».
Они сосредоточили большую часть своего анализа на орбитофронтальной коре в каждом полушарии. Одним из многих сделанных ими наблюдений было то, что потеря синапсов была сосредоточена в областях, где было прямое перекрытие с амилоидными бляшками. За пределами областей бляшек плотность синапсов была такой же высокой в мозге с болезнью Альцгеймера, как и в мозге без этого заболевания.
По словам Чунга, имея всего два образца, команда, конечно, не делает никаких выводов о природе болезни Альцгеймера, но суть исследования в том, что теперь появилась возможность полностью визуализировать и глубоко анализировать полушария человеческого мозга, что позволяет проводить именно такие исследования.
Примечательно, что эта технология одинаково хорошо применима ко многим другим тканям организма, а не только к мозгу.
«Мы предполагаем, что эта масштабируемая технологическая платформа улучшит наше понимание функций органов человека и механизмов заболеваний, что подстегнет разработку новых методов лечения», — заключают авторы.
telegram - https://t.me/+1Kn84vBksb9lM2Iy