Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов - это высокотехничная и
трудоемкая процедура. Из-за специфики процедуры ИКСИ яйцеклетки необходимо хранить вне инкубатора, поэтому общая лабораторная обстановка играет ключевую роль в воспроизводимости и успехе ИКСИ. Яйцеклетки необходимо очистить от клеток кумулюса, чтобы можно было визуализировать зрелость ядра и провести правильную инъекцию. Проведение ИКСИ чрезвычайно важно во времени, поскольку требуется надлежащая зрелость яйцеклетки и адекватная инкубация мужских половых клеток. Действительно, правильный выбор времени между введением хорионического
гонадотропина человека (ХГЧ) и его извлечением имеет решающее значение в
достижение нуклеоцитоплазматического созревания in vivo . Однако эти
этапы созревания женских половых клеток in vivo менее актуальны при традиционном оплодотворении in vitro. Среда, используемая для выведения гамет из инкубатора, требует использования буфера, состоящего из 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты. Колебания этих факторов окружающей среды могут отрицательно сказаться на оплодотворении, а также на потенциале развития эмбриона.
Сообщалось, что воздействие высокой температуры на собранные
яйцеклетки может вызвать спонтанную активацию ооцитов, тогда как низкая температура более терпима, но все же может повлиять на полимеризацию микротрубочек, что приводит к необратимому повреждению веретенообразного комплекса зрелой яйцеклетки и, предположительно, к анеуплоидии эмбриона. Эти аспекты не применимы для обычного оплодотворения in vitro, поскольку гаметы содержатся в инкубаторе в стабильных условиях, пока происходит процесс оплодотворения.
Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов изменила представление о мужском бесплодии, продемонстрировав, что низкая концентрация сперматозоидов или их слабая подвижность не обязательно означают неспособность к зачатию здоровых детей.
Акросомальная функция и капацитация.
Доступность ИКСИ также поставила под сомнение необходимость в особых компонентах сперматозоида, таких как акросома, специализированная
везикулярная структура на проксимальном конце головки сперматозоида,
которая играет решающую роль в физиологическом оплодотворении,
способствуя проникновению в блетсящую оболочку (ZP) для слияния с яйцеклеткой. При традиционном экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) сперматозоиды должны пройти акросомальную реакцию и капацитацию, чтобы проникнуть в прозрачную оболочку и оплодотворить яйцеклетку. Однако при ИКСИ этот этап является полностью исключен. В частности, у некоторых мужчин, страдающих глобозооспермией с полным отсутствием акросомы, ИКСИ является единственным методом, способным обеспечить оплодотворение, если он подкреплен искусственной активацией яйцеклеток.
Функция центросомы.
Центросома, еще один важный компонент мужской гаметы, отвечает за организацию микротрубочек во время зиготического деления у большинства мужчин. В пилотном исследовании, опубликованном в 1994 году, а затем в 1997 году, позволили установить отцовскую наследственность центросомы человека. В случае 3-х пронуклеарных (PN) зигот, полученных в результате стандартного оплодотворения in vitro, эти эмбрионы унаследовали 2 центриоли сперматозоидов, что привело к триполярному веретену и к неравномерному делению эмбриона с хаотической хромосомной мозаичностью. Напротив, зиготы 3PN, полученные в результате ИКСИ, были дигиническими триплоидами, содержащими дополнительный материнский геном, полученный в результате неудачной экструзии второго полярного тельца. Хотя в результате обширных экспериментов, проведенных на низших млекопитающих, формулируются альтернативные гипотезы, эта догма остается верной.
Геномная и эпигеномная компетентность.
Эти тесты особенно важны для выявления скрытого мужского фактора и для определения причины неэффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и адаптации последующих циклов ИКСИ, особенно для пар с бесплодием неясного генеза. Например, с помощью секвенирования ДНК сперматозоидов у пар с неудачным оплодотворением, плохим развитием эмбриона, неудачами имплантации или потерей беременности были выявлены новые мутации в генах, ответственных за возникновение кальциевых колебаний, которые запускают активацию яйцеклеток, стабилизацию веретена/микротрубочек, имплантацию эмбриона и развитие трофобласта
Для пар с полной неудачей оплодотворения в анамнезе - последующий цикл ИКСИ, с воздействием ионофоров кальция, успешно давал оплодотворение.
В парах с низким качеством эмбрионов в анамнезе и мужским фактором с высокой фрагментацией ДНК улучшенный отбор сперматозоидов, такой как микрофлюидика, позволил отобрать сперматозоиды с меньшим повреждением ДНК сперматозоидов; после микрофлюидального отбора сперматозоидов в последующих циклах ИКСИ было получено больше эуплоидных эмбрионов.
Генетическое исследование также продемонстрировало корреляцию между возникновением мейотических ошибок и увеличением возраста отца.
За 3 десятилетия, прошедшие с момента внедрения ИКСИ, появилось несколько предполагаемых дополнений к традиционной ИКСИ, включая физиологическую интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов (ICSI) и интрацитоплазматическую инъекцию морфологически отобранных сперматозоидов (IMSI). Однако их предполагаемые преимущества не
привели к заявленному улучшению по сравнению со стандартной ИКСИ.
Физиологическая интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов - это еще одно предлагаемое дополнение к традиционной ИКСИ, цель которого - улучшить отбор зрелых сперматозоидов для инъекции. В отличие от традиционной ICSI, PICSI включает в себя специальную чашку, покрытую гиалуроновой кислотой (HA), предназначенную для имитации процесса естественного отбора, который происходит с богатыми гиалуронаном ооцит-кумулюсными комплексами . Однако наше собственное исследование по выделению НА-отобранных отобранных с помощью HA, не показало каких-либо улучшений по сравнению с получением случайно отобранных мужских половых клеток. Это было подтверждено более поздним хорошо проведенным исследованием, которое не выявило существенных преимуществ
процедуры, за исключением небольшого снижения частоты потери беременности
Гистоны.
Генетический материал сперматозоидов сильно уплотнен, что является ключевым фактором, позволяющим сперматозоиду доставлять отцовскую ДНК для оплодотворения. В идеале примерно 85% ДНК сперматозоидов в процессе спермиогенеза претерпевает превращение из гистона в протамин с образованием плотно уплотненных тороидных структур, тогда как оставшаяся ДНК сохраняется в виде нуклеосом в линкерных областях. Эти линкерные участки более подвержены повреждениям факторов окружающей среды или образа жизни. Эта изменчивость сперматозоидов в основном влияет на развитие эмбриона и коррелирует с более высокой частотой потери беременности, даже при проведении ИКСИ
Плоидность.
Скрининг сперматозоидов на плоидность выявляет сперматозоиды с
правильным содержанием гаплоидных хромосом с помощью
FISH или секвенирования нового поколения.
Еще одним преимуществом ИКСИ является возможность индивидуального отбора сперматозоидов на основе их подвижности в определенных градиентах плотности. Наблюдение за движением жгутиков сперматозоидов с помощью гидродинамического интегративного анализа, включая морфологию клеток, метаболические и сигнальные функции, может стать дополнительным критерием для абсолютной идентификации желаемого пола сперматозоида .
Безопасность ИКСИ
С момента создания ICSI в 1992 году на свет появилось более 5 миллионов младенцев. В первоначальном последующем исследовании, проведенном в США, распределение по полу, гестационный возраст и масса тела при рождении у детей, зачатых с помощью ИКСИ, и у детей, зачатых с помощью стандартного ЭКО, были одинаковыми, в то время как частота пороков развития
был ниже у детей, зачатых с помощью ИКСИ. Проспективное исследование 5-летних детей, зачатых с помощью ЭКО, не выявило существенных различий в состояниифизического здоровья среди 66 детей, зачатых с помощью ИКСИ, 52
Зачатие с помощью ЭКО и 59 доношенных детей, зачатых естественным путем. В другом исследовании у детей 8-10 лет не было выявлено существенных различий в когнитивном и двигательном развитии, зачатых с помощью ИКСИ, и у их сверстников, зачатых естественным путем. У подростков, зачатых с помощью ИКСИ, наблюдалось нормальное половое развитие. Наиболее обнадеживающим является тот факт, что у детей, зачатых с помощью ИКСИ,
доказан нормальный репродуктивный потенциал. Среди зачатых с помощью ИКСИ у лиц с олигозооспермией не было никакой корреляции
между параметрами спермы отцов и их сыновей, за исключением слабой отрицательной корреляции с общим количеством сперматозоидов.
Более того, дальнейшая тяжелая олигоспермия не увеличивала
вероятность того, что у сына будет более низкая концентрация сперматозоидов
У женщин, зачатых с помощью ИКСИ из-за мужского фактора бесплодия у их отцов, уровень АМГ, ФСГ, ЛГ и дигидроэпиандостерона сульфата (ДГЭАС) аналогичен таковому у женщин, зачатых естественным путем. Среднее количество фолликулов на один яичник также было одинаковым в группах, получавших ИКСИ, и в группах, зачатых естественным путем.
ИКСИ: первая инстанция или последнее средство
Немного истории...
В начале 1992 года в Брюсселе была замечательная лекцию Андре Ван
Стейртегема о новом подходе к оплодотворению, который включал прямое введение сперматозоида в яйцеклетку с помощью микроманипуляционной установки; метод, который мы теперь знаем как ИКСИ. Происхождение этого открытия хорошо задокументировано, и, как это часто бывает с важными научными достижениями, оно стало результатом ошибки. Группа Ван Стейртегема экспериментировала с субзональным оплодотворением, а
методика, которая включала инъекцию живого сперматозоида, реагирующего на акросомы, в подзональное пространство, чтобы избежать необходимости пересечения прозрачной зоны - основного препятствия для оплодотворения в случаях мужского бесплодия. Процедура была деликатной, и иногда недостаток сноровки со стороны эмбриолога мог привести к тому, что сперматозоид, получивший физическую травму, случайно попадал в яйцеклетку. Удивительно, но такие ‘неудачные субзональные инсеминации’ приводили к нормальной активации яйцеклетки, формированию пронуклеуса и началу деления эмбриона
В конечном счете, ИКСИ оказалась очень ценным терапевтическим методом, особенно в случаях тяжелого мужского бесплодия. Именно для этой цели изначально была разработана ИКСИ, тем самым заполняя очень важный клинический пробел в нашем терапевтическом арсенале: до тех пор, пока в яичках, придатке яичка или эякуляте можно было обнаружить хотя бы один сперматозоид, пациент потенциально поддавался лечению. Действительно, эта
техника была настолько эффективна, что ее применение распространилось,
подобно ряби на пруду. В результате своей популярности ICSI в настоящее время часто используется для лечения немужского бесплодия, исходя из предположения, что это повысит уровень оплодотворения, и процедура не принесет вреда. К сожалению, эта логика ошибочна в обоих случаях.
Прежде всего, в случаях немужского бесплодия показатели успешности ИКСИ ничем не отличаются от показателей обычного ЭКО. У женщин старшего репродуктивного возраста ИКСИ не дает никаких преимуществ по сравнению с ЭКО с точки зрения показателей оплодотворения, образования зигот, переносимости эмбрионов или живорождаемости. А чего мы могли ожидать?
Возраст матери снижает потенциал развития яйцеклеток с помощью различных механизмов, включая окислительный стресс и индукцию анеуплоидии . Поскольку физическое введение сперматозоида в яйцеклетку не может изменить ни оксидативный стресс, ни нормализовать число хромосом.
Аналогичным образом, ИКСИ абсолютно неэффективна в случаях идиопатического бесплодия, когда она приводит к более низким показателям оплодотворения, чем ЭКО, без улучшения показателей живорождения). И снова, почему мы должны удивляться? Идиопатическое бесплодие имеет сложную этиологию, в которой участвуют как мужчины, так и женщины. Появляется все больше доказательств того, что патофизиология этого состояния связана с оксидативным стрессом и/или генетическими мутациями, и, по логике вещей, ни один из этих предполагаемых патологических механизмов не может быть исправлен физическим введением сперматозоида в яйцеклетку. У пациентов с трубным фактором, ИКСИ не дает статистически значимого улучшения по сравнению с ЭКО в отношении частоты оплодотворения, в то время как вероятность наступления клинической беременности и живорождения фактически снижается.
Так зачем же мы это делаем?
Это одна из загадок жизни. Использование ИКСИ за пределами тяжелого мужского бесплодия не дает существенных преимуществ пациентам, а на самом деле ставит их в невыгодное положение из-за дополнительных затрат на лечение. Что касается риска, то основная проблема заключается в том, что ИКСИ увеличит мутационную нагрузку на создаваемые эмбрионы.
Поврежденные окислением сперматозоиды, имеющие высокий уровень повреждения ДНК, обычно не могут участвовать в оплодотворении из-за сопутствующего повреждения плазматической оболочки сперматозоидов. Однако при ИКСИ эти биологические меры предосторожности полностью обходятся. Если ИКСИ проводится с использованием нормальных здоровых сперматозоидов, нет причин ожидать аномального результата. Таким образом, простое сравнение ЭКО и ИКСИ без учета качества введенных сперматозоидов бессмысленно.
Что нам следует делать? Принять тот набор данных, который соответствует нашим предубеждениям, и отвергнуть другой?
Наиболее подходящим ответом будет признание того факта, что геном человека содержит 3 миллиарда пар оснований, только 1% из которых кодирует белки. В результате, геном человека содержит вероятность того, что случайная мутация de novo в эмбрионе, зачатом с помощью ИКСИ, вызовет заметный патологический исход, ничтожно мала. Однако отсутствие доказательств не является доказательством отсутствия. Таким образом, низкий уровень заболеваемости после ИКСИ не должен нас сильно утешать или закрывать глаза на генетические последствия этой технологии.
Наконец, мы должны также признать, что в дополнение к возникновению новых мутаций, неизбирательное использование ИКСИ способствует распространению генотипов с низкой фертильностью внутри страны.
Таким образом, многие мутации, ответственные за мужское и женское бесплодие, поддаются лечению с помощью ИКСИ и будут сохранены потомством в результате применения этой технологии, например, делеции AZFc (азооспермического фактора с) в Y-хромосоме, цилиарные дискинезии, мутации в зоне 4 (ZP4) и другие состояния.
Было бы разумно использовать ИКСИ крайней мерой лечения и применять специально для случаев тяжелого мужского бесплодия. Этого можно достичь с помощью тестикулярных сперматозоидов, которые, как правило, имеют очень низкий уровень повреждения ДНК и соответственно, низкую способность вызывать мутации de novo после зачатия . Также можно пробовать использовать передовые методы выделения сперматозоидов, или можно рассмотреть возможность применения антиоксидантной терапии