За последние четыре десятилетия в области вспомогательных репродуктивных технологий были достигнуты значительные успехи, что привело к повышению показателей наступления беременности и уменьшению осложнений, в частности, к снижению частоты многоплодных беременностей.
Условия культивирования, применяемые в современных лабораториях, статичны и лишь имитируют физиологическую среду женских репродуктивных путей, в которых эмбрион динамически подвергается действую различных факторов ( перемещается от ампулярного отдела маточной трубы к месту имплантации в матке).
Важно отметить, что хотя составы культуральных сред и играют решающую роль в оптимизации развития эмбрионов, не менее важен и целый ряд дополнительных факторов, таких как pH среды, температура, осмоляльность, газовый состав и воздействие света. Все эти факторы необходимо тщательно контролировать, уменьшить негативное воздействие на эмбрион и обеспечить оптимальный потенциал имплантации.
Основная задача - создать благоприятную среду для развития эмбрионов, минимизировав при этом любое ятрогенное негативное влияние на развитие эмбриона.
В настоящее время лаборатории ЭКО культивируют эмбрионы до стадии бластоцисты с высокой эффективностью, что позволяет осуществлять выборочный перенос одного эмбриона (селективный эмбриотрансфер) , в результате чего число многоплодных беременностей снижается при сохранении высоких показателей наступления беременности.
Эмбриологическая лаборатория должна обеспечить оптимальные условия культивирования для поддержки роста здоровых эмбрионов с высоким потенциалом имплантации.
Немного исторической справки.
Первые среды для культивирования эмбрионов были основаны на простых питательных средах с добавлением бычьего сывороточного альбумина , пенициллина и пирувата натрия, фенолового красного и бикарбоната, иногда, сдобавлением сыровотки пациентов.
Для первого успешного ЭКО, которое завершилось рождением ребенка (в результате которого родилась Лузи Браун) , использовалась среда Эрла с простым солевым раствором с добавкой пирувата и сывороткой пациента.
Изначально было установлено, что в естественных условиях получение энергии эмбрионом на ранних стадиях развития происходит за счет метаболизма пирувата/лактата, а после активации эмбрионального генома эмбрион переключается на метаболизм с использованием глюкозы. На понимании этого механизма основано использование для культивирования эмбрионов двухшаговых сред; при этом на 3 сутки культивирования происходит замена среды.
Однако позднее был предложен метод « простой оптмизации» - выбора среды, с содержанием химических веществ, при наборе которых экспериментально были получены наилучшие результаты культивирования – так была разработана простая оптимизированная среда, которая не требует замены весь процесс культиврования, а значит, снижает вероятность негативного стрессового влияния этого процесса на эмбрионы.
Далее рассмотрим, что входит в состав питательных сред, и какое влияние эти вещества могут оказывать на развитие эмбрионов.
Углеводы
- Все питательные среды содержат в качестве источников углеводов пируват, лактат и глюкозу в разных концентрациях , точный состав питательных средств не раскрывается производителями.
Аминокислоты
- содержание определенных аминокислот по-разному влияет на процессы эмбрионального развития ( есть данные, указывающие на то, что дефицит некоторых аминокислот, например, метионина , связан с формированием монозиготных близнецов у людей; заменимые аминокислоты способствуют вылуплению эмбриона из блестящей оболочки)
- избыток аминокислот в культуральной среде ( особенно глутамина) может приводить к увеличению концентрации аммония в среде, что будет оказывать губительное воздействие на эмбрион. В современных средах эта проблема решается заменой одной из самых нестабильных аминокислот - глутамина более стабильной формой дипептита аланил-глутамина или глицин - 1 глутамина, чтобы значительно снизить накоплением аммония в средах и избежать создания токсичной для эмбрионов среды.
Источники белка и макромолекул
Было установлено, что добавление в среду макромолекул улучшает развитие эмбриона и положительно влияет на рождаемость
в качестве основного источника макромолекул в современные среды добавляют человеческий сывороточный альбумин или белковые комплексы, которые еще содержат комбинацию альфа- и бета- глобулинов
- добавление альбумина сводит к минимуму " прилипание" гамет и эмбрионов к расходным материалам, а также стабилизирует клеточные мембраны, помогает стабилизировать цитоскелет клеток при размораживали криоконсервированных эмбрионов
- гиалуроновая кислота ( в некоторых исследованиях продемонстрировано увеличение частоты имплантации и клинической беременности ; в других - увеличение частоты живорождения при культивировании эмбрионов в среде c содержанием гиалуроновой кислоты, однако данные требуют дополнительного изучения)
- ГМ- КСФ ( одни исследования не подтверждают положительное влияние добавления этого фактора в питательные среды на частоту наступления беременности, другие - сообщают о увеличении показателей клинической беременности и живорождения. Вопрос положительного влияние ГМ-КСФ остается открытым и требует качественных исследований).
Концентрация кислорода и его активных форм ( АФК)
Кислород необходим для митохондриального окислительного фосфорилирования, однако в процессе электроннотранспортной цепи может происходить "утечка" высокоэнергетический электронов и формирование АФК.
АФК могут нарушать клеточный метаболизм, целостность генома, увеличивать фрагментами ДНК, снижать жизнеспособность эмбрионов.
Концентрация кислорода в репродуктивных путях самок колеблется от 2 до 8%. Культивирование эмбрионов в среде, где содержание кислорода такое же, как в атмосферном воздухе ( 20%) может приводить к увеличению продукции АФК и неблагоприятным последствиям этого.
Культивирование эмбрионов при низкой концентрации кислорода коррелирует с более быстрым развитием эмбрионов и меньшими нарушениями в структуре экспрессии генов.
Современные методы культивирования рекомендуют концентрацию кислорода в инкубаторе 5%.
Польза антиоксидантных добавок
В исследованиях было рассмотрено добавление антиоксидантов ( N- ацетил-цистеин, ацетил- L- карнитин, альфа- липовая кислота) в среды для культивирования эмбрионов ) в некоторых исследованиях было отмечено увеличение частоты наступления беременности и родов, особенно положительная роль таких добавок становится заменена прикультивировании эмбрионов пациентов в возрасте 35-40 лет.
Другие параметры, влияющие на культуральные среды
- Температура
Оптимальной температурой для культивирования эмбрионов считается температура 37C.
В исследовании и не получили достоверных отличий в частоте оплодотворения, качестве эмбрионов, частоте живорождения при сравнении результатов культивирования эмбрионов в среде со стабильной температурой 37C и среде, в которой происходило постепенное изменение температуры от 36,6C до 37,5С в течение дня.
- pH
постоянство pH среды достигается добавлением в нее буферов , важно, чтобы буфер не только эффективно работал, но и был безопасен для развития эмбрионов.
- осмоляльность среды
Различные исследования показали, что высокая осмоляльность отрицательно влияет на объем клеток, стабильность мембран, а изменение осмоляльности может вызывать клеточный стресс и подавлять развитие эмбриона.
Показано, что эмбрионы млекопитающих оптимально развиваются при осмоляльности 255- 295мОсм/кг.
Необходимо последовательное соблюдение лабораторных протоколов , чтобы гарантировать постоянство осмоляльности среды , заявленной производителем, и оптимальное развитие эмбриона.
- покрытие капель со средой маслом
масло снижает испарение среды, служит буфером между культуральной средой и окружающим воздухом , поддерживает стабильный уровень pH, контролирует температуру и отделяет среду от потенциально токсичных соединений и вредных микроорганизмов, присутствующих в воздухе.
- пластиковые расходные материалы, используемые в эмбриологической лаборатории
пластиковые материалы могут выделять определенные молекулы или химические соединения, которые могут быть токсичными для эмбриона, поэтому крайне важно, чтобы каждая лаборатория выполняла программу обеспечения качества и мониторинга продуктов, используемых в их клинике.
Заключение:
В лабораториях ЭКО был достигнут значительный прогресс, который привел к улучшению показателей наступления беременности и одновременному снижению числа многоплодных беременностей. Считается, что этот прогресс продолжится и в будущем, благодаря использованию новых инженерных (микрофлюидных, ИИ) и молекулярных (неинвазивное метаболическое или транскриптомное тестирование эмбрионов) решений. Однако также очевидно, что каждый фактор (тип среды, концентрация кислорода, пластиковая посуда, масло и т. д.), участвующий в манипуляциях с гаметами или эмбрионами, оказывает глубокое влияние на развитие эмбрионов. Клеточные стрессоры, такие как pH, АФК, осмоляльность и температура, могут играть ключевую роль в обеспечении оптимального развития эмбриона и, если их не контролировать должным образом, могут оказывать негативное воздействие, в конечном итоге снижая потенциал имплантации. Тщательный контроль качества в лаборатории и новые исследования по улучшению развития эмбрионов всегда будут незаменимым аспектом лаборатории ЭКО.
