Криоконсервация семени лабораторных животных является важным звеном при создании современных криобанков генетических ресурсов. Хотя на сегодняшний день заморожено семя нескольких десятков видов млекопитающих, однако до сих пор не было данных по замораживанию семени хомячков рода Phodopus.
В мировой практике, по лабораторным животным, наилучший результат при замораживании семени был получен на лабораторной мыши, для которой в качестве криопротекторов используют обезжиренное сухое молоко и раффинозу. Само замораживание осуществляют путем погружения соломины с раствором семени и криопротектора в жидкий азот, перед этим выдерживая образец в его парах в течение нескольких минут. У данного протокола есть целый ряд преимуществ, поскольку он не требует программного замораживателя и эффективен по отношению к большинству изученных линий мышей, причем после размораживания процент живых сперматозоидов для разных линий мышей составляет 40-70 %.
Гораздо сложнее обстоит ситуация с криоконсервацией крысиного семени. Несмотря на то, что крыса является вторым по степени востребованности лабораторным животным, потребовалось ещё десятилетие с момента успешных работ по замораживанию семени мышей, для того, чтобы получить первый положительный результат замораживания семени крыс. Ранее был разработан криопротектор, который состоит из яичного желтка, моногидрата лактозы и трис-гидроксиметил-аминометана. Также как и для мышей, замораживание семени крыс, проводится без использования программного замораживателя. При этом процент жизнеспособного семени после оттаивания составляет всего около 10 %. Этих сперматозоидов вполне достаточно для классического экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), либо интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Из анализа литературы следует, что из значимых для биомедицинских исследований лабораторных животных, лишь по отношению к мыши разработан общепринятый метод замораживания сперматозоидов, который признаётся большинством исследователей, и применение которого приводит к воспроизводимому результату. По отношению же к другим лабораторным животным такого общепринятого метода не существует.
Замораживание семени представителей рода Phodopus (P. sungorus и P. campbelli) было выполнено нами впервые в мировой практике. При этом протоколы, которые успешно используют для мышей и крыс оказались малоэффективными. Наилучшие результаты удалось получить при использовании криопротектора на основе разбавителя семени CaniPlus Chill Extender, в который был добавлен глицерин и яичный желток. Сходный результат был получен и при использовании фирменного криопротектора CaniPlus Freeze Extender, который предназначен для замораживания семени сельскохозяйственных животных. Криопротекторные смеси на основе разбавителей CaniPlus/CaniPRO используют для замораживания семени собак, дальневосточного лесного кота и даже бурого медведя. Как было показано в нашем исследовании CaniPlus Chill и CaniPlus Freeze подходят и для замораживания семени хомячков рода Phodopus, хотя эффективность процедуры была не велика.
По результатам морфологического анализа мазков и анализа жизнеспособности сперматозоидов методом двойного окрашивания "SYBR Green I + PI" после процедур замораживания-оттаивания можно заключить, что для эпидидимального семени двух исследованных видов хомячков CaniPlus Chill и CaniPlus Freeze являются более эффективными криопротекторными смесями по сравнению с протоколом "рафиноза + сухое молоко". У мохноногих хомячков типичным криоповрежденем сперматозоидов можно считать различные нарушения со стороны акросомы. Наш анализ показывает, что разрывы и деформации акросомы довольно часто встречаются и в интактных образцах эпидидимального семени данных видов. Процедуры замораживания-оттаивания усиливают “хрупкость” акросомы, что существенным образом снижает жизнеспособность сперматозоидов после криоконсервации.
В существующих в мире криобанках семени исчезающих и экзотических видов млекопитающих не представлены хомячки рода Phodopus. Предложенный нами метод замораживания семени с применением CaniPlus Chill и CaniPlus Freeze позволяет сохранить биоразнообразие мохноногих хомячков, и может рассматриваться как перспективный для применения на других видах Cricetinae.
(с) Евгений Юрьевич Брусенцев