Окраска ГЭ — это обязательный этап для любого гистологического исследования.
По препаратам, окрашенным этим методом, можно поставить большинство гистологических диагнозов, увидеть основные структуры и составляющие исследуемого объекта. Прежде чем окрасить препарат, нужно сначала высушить его и обезводить. Высушивание стекла с парафиновым срезом
Оптимальные методы: - выловить срез на стекло и оставить при комнатной температуре до утра - вертикально высушить срез на стекле в термостате 60оС в течение 1 часа - поместить для сушки в нагревательный отсек стейнера Другие методы: - поместить на воду на предметном стекле и подогревая над спиртовкой расправить складки - поместить срез в водяную баню, выловить на стекло и подогреть над пламенем спиртовки (или феном) - горизонтально подогреть на нагревательном столике. После того, как срез высушен, можно приступить к окраске.
Общие этапы для удаления парафина перед окраской.
Депарафинирование Ксилол (или его заменитель) 3 смены по 3 минуты Этанол (или изопропанол) 3 смены по 1-2 минуты Дистиллированная или деионизированная вода 1-2 мин или дольше (сколько необходимо) Замена первых реактивов производится через каждые 60-80- 100 стекол. Первые реактивы (ксилол и спирт) выливаются, следующие перемещаются на одну позицию влево. Последние - свежие. Депарафинирование должно осуществляться при температуре не ниже 20оС, иначе парафин очень плохо удаляется из срезов и блокирует участки, подлежащие окрашиванию.
Окраска Гематоксилин бывает 2 типов: прогрессивный, который не требует последующего извлечения избытка красителя, и регрессивный, который красит избытком красителся с последующей его отмывкой. Прогрессивный окрашивает от 3 и до 20 минут (в зависимости от длительности использования и чистоты красителя). Регрессивный до 10 сек и до 5 минут (можно дольше). После каждого красителя применяют проточную воду 1-5-10 минут (выполняет роль подсинивающего буфера). После регрессивного гематоксилина ставится проточная вода на 1 мин, далее - дифференцирующие растворы (солянокислый спирт 0.25-1% на 70-96% этаноле или 0.25-0.5% водная соляная кислота). Количество погружений стекол в раствор устанавливается опытным путем с последующим контролем под микроскопом. После - промывка в 2 сменах проточной воды по 1 минуте в каждой, затем третья смена проточной воды от 3 мин и более, до того, как все ядра клеток станут синими.
Необходимо фильтровать любой гематоксилин после работы и доливать до уровня свежим. Подсинивание можно выполнять с помощью подсинивающих растворов. Оптимальные: - промывочный буфер для ИГХ (PBST или TBST) - вода Скотта - мраморная крошка в проточной воде. Менее эффективные подсинивающие агенты — раствор аммиака или пары аммиака. При обработке этими реактивами срезы могут слезть со стёкол. Далее стекла помещают в дистиллированную или деоинзированную воду. Лучше сделать 2 смены по 2 минуты, чтобы удалить остатки подсинивающих буферов - они извлекают окраску эозином. Окраска эозином возможна красителями, содержащими разный процент эозина на основе спирта, воды или вода+спирт (оптимальный вариант). Время окраски эозином от 10 сек до 3 мин. После стекла переносят в дистиллированную воду для отмывки избытка эозина или в спирт, если используется спиртовой раствор красителя. Избыток эозина можно отмыть опусканием стекла последовательно в спирт-воду-спирт до тех пор, пока не будет достигнут желаемый оттенок. При этом нужно помнить, что последующими спиртами может быть извлечено еще какое-то количество эозина. Длительность этапов отмывки определяется экспериментально и контролируется визуально под микроскопом. Эозин, как и гематоксилин, необходимо ежедневно фильтровать, доливая до уровня свежим раствором.
Обезвоживание. После эозина идут 3-4 смены этанола или изопропанола по 2 мин каждая. Первая смена выливается через 60-8-100 стекол, или при помутнении. Остальные переставляются на одну позицию влево, так, чтобы последняя получилась свежая. Просветление. Происходит посредством 2 смен ксилола по 1 минуте. Карбол-ксилол совершенно лишний в этом процессе при условии своевременной замены реактивов.
Протоколы окраски
ГЭ Ручной протокол :
Ксилол 3 мин
Ксилол 3 мин
Ксилол 3 мин
Этанол (ИПА) 2 мин
Этанол (ИПА) 2 мин
Этанол (ИПА) 2 мин
Дистиллированная вода 2 мин Гематоксилин 3-20 мин (в зависимости от типа)
Проточная вода 2 мин Дифференцирующий раствор 10 сек - 1 мин (для регрессивного; время зависит от типа раствора)
Проточная вода 3-5 мин или подсинивающий раствор (можно дольше - до синих ядер)
Дистиллированная вода 2 смены по 2 мин
Эозин 10 сек — 3мин
Дистиллированная вода 1 минута или дольше
Этанол (ИПА) 3 мин
Этанол (ИПА) 3 мин
Этанол (ИПА) 3 мин
Этанол (ИПА) 3 мин
Ксилол 1 минута
Ксилол 1 минута (или дольше, если необходимо).
Общее время процесса: 44 мин - 60 мин.
Для окраски в стейнерах протокол может быть похожим, но не каждый стейнер имеет столько станций для реагентов. Иногда полностью соблюсти вышеописанный протокол не представляется возможным, поэтому приходится жертвовать этапами с дистиллированной водой и дифференцировкой, а также сокращать этапы с этанолом и ксилолом. В этом случае необходимо чаще менять ксилолы и спирты, а также красители, т.к. увеличивается их расход, что, кстати, влияет на себестоимость исследования. Очень желательно на рабочем месте для окраски иметь работоспособный микроскоп с малым увеличением (10х). Контролируйте вашу окраску перед подачей стекол патологам!
Автор статьи:
Юнусов Теймур Юнусович
