Имплантация эмбриона
— сложный, но важный процесс наступления беременности, который происходит при миграции компетентного эмбриона в полость матки и его прикреплении и внедрении к рецептивному эндометрию.
- Вероятность достижения беременности в период «окна имплантации» составляет всего 30%.
- В связи с этим огромное внимание к себе привлекли внеклеточные везикулы (ВВ), которые представляют собой компартменты, закрытые мембраной, секретируемые всеми типами клеток во внеклеточную среду.
- Внеклеточные везикулы транспортируют груз микроРНК, состав которых меняется на протяжении менструального цикла и способствует процессу имплантации во время окна имплантации.
Цель данного исследования:
1. Охарактеризовать груз микроРНК внеклеточных везикул, секретируемых первичными эпителиальными клетками эндометрия человека (pHEEC);
2. Подтвердить поглощение внеклеточных везикул человеческими эмбрионами и выяснить их потенциальную роль в регуляции компетентности эмбрионов и успешности имплантации.
Дизайн исследования.
- Проспективное описательное исследование.
- Биопсии эндометрия были собраны у здоровых доноров ооцитов с подтвержденной фертильностью в день забора ооцитов через 36 часов после всплеска ЛГ.
- Первичные эпителиальные клетки эндометрия человека выделяли из биоптатов эндометрия (n = 24: 8 биопсий x 3 пула) и культивировали in vitro. Впоследствии кондиционированную среду собирали и из неё выделяли внеклеточные везикулы.
- Анализировали поглощение человеческими бластоцистами внеклеточных везикул и их груз микроРНК.
Материалы и методы.
- Внеклеточные везикулы были выделены из кондиционированной культуральной среды с помощью ультрацентрифугирования, характеристика проводилась с использованием вестерн-блоттинга, анализа отслеживания наночастиц и трансмиссионной электронной микроскопии.
- Внеклеточные везикулы были флуоресцентно помечены церамидом Bodipy-TR, и их поглощение бластоцистами человека было проанализировано с помощью конфокальной микроскопии.
- Анализ груза микроРНК внеклеточных везукул проводили с помощью секвенирования микроРНК, аннотировали гены-мишени наиболее экспрессируемой микроРНК, а также был проведен анализ функционального обогащения.
Результаты.
1. Внеклеточные везикулы, секретируемые материнским эндометрием, эффективно и быстро поглощаются человеческими эмбрионами.
Интернализация достигается всем эмбрионом через 2 часа.
Это предполагает, что внеклеточные везикулы могут проходить через зону пеллюцида (ZP).
2. Первичные эпителиальные клетки эндометрия человека (pHEEC) были успешно выделены из биоптатов эндометрия, о чем свидетельствует двойное иммунофлуоресцентное окрашивание, положительное на панцитокератин и отрицательное на виментин.
3. Клетки подвергались гормональной обработке для достижения реактивной клеточной стадии, что подтверждается подавлением PGRMC1 и активацией PGRMC2.
4. Наночастицы, выделенные из культуральной среды первичных эпителиальных клеток эндометрия экспрессируют трансмембранные белковые маркеры CD9 и CD81.
Это подтверждает двухслойную структуру липидов внеклеточных везикул.
5. Внутрипросветные белковые маркеры HSP70 (белок теплового шока) и ТSG101 (ген предрасположенности к опухоли) подтвердили, что первичные эпителиальные клетки эндометрия секретируют внеклеточные везикулы.
6. Анализ распределения по размерам показал, что первичные эпителиальные клетки эндометрия секретируют как малые (<200 нм), так и средние/большие внеклеточные везикулы (>200 нм).
7. Глубокое секвенирование выявило 149 микроРНК в внеклеточных везикулах эндометрия, связанных с ранним развитием эмбриона, метаболизмом кислорода (переход к аэробному метаболизму), клеточным циклом, дифференцировкой и апоптозом.
8. Были идентифицированы гены семейства let-7, которые способствуют приобретению эндометрия адгезионно-компетентного состояния во время окна имплантации.
Подавление некоторых членов семейства let-7, таких как let-7a, let-7f-5p, let-7g-5p, let-7e-5p и let-7d-5p, может приводить к самопроизвольным выкидышам.
8. МикроРНК, экспрессирующиеся в внеклеточных везикулах, напрямую связаны с ранним развитием эмбрионов: miR-200c-3p, miR- 23a-3p, let-7b-5p, and miR-92a-3p.
Выводы.
Внеклеточные везикулы, секретируемые эмбрионами, могут интернализоваться клетками эндометрия, улучшая состояние эндометрия, его восприимчивость и, наоборот, внеклеточные везикулы, секретируемые клетками эндометрия, могут поглощаться сфероидами, полученными из клеток трофобласта, что усиливает адгезивные и инвазивные способности эмбриона.
Таким образом,
данное исследование открывает возможности для дальнейших исследований по описанию потенциальных биомаркеров восприимчивости эндометрия и компетентности эмбриона, которые могут быть полезными диагностическими критериями для успеха имплантации.