Если в античной литературе единорог рассматривался как всего лишь одна из диковин, то в христианстве формируется целая аллегорическая и мифологическая традиция. Несмотря на то, что зверь ассоциировался с языческими божествами, отцы основатели христианской церкви сделали этот образ весьма популярным, истолковывая его в духе религиозной аллегории, которая постепенно становилась все шире по охвату и глубже по содержанию.
В Библии единорог появляется в Книге Иова (59:9-1Т) и описан как животное, наделенное недюжинной силой:
«Захочет ли единорог служить тебе и переночует ли у яслей твоих?! Можешь ли верёвкой привязать единорога к борозде, и станет ли он боронить за тобою поле? Понадеяться ли на него, потому что у него сила велика, и предоставить ли ему работу твою?»
В V веке единорог стал христианским символом, а также популярным персонажем историй и легенд, в которых привычки и характеристики животных объяснялись через призму христианской доктрины. Символика единорога играет существенную роль в средневековых христианских сочинениях, восходящих к греческому тексту «Физиолога» (VII в до н.э.). Изначально написанный на греческом языке, возможно, в Александрии, текст содержит описания мифических и причудливых существ. Каждый отчет заканчивается определенной нравственной догмой в качестве поучения. «Физиолог» был переведен на латинский язык в V веке. Особой популярностью этот текст пользовался в Средние века. Он был переведен на другие языки, увеличилось и количество сказочных существ. Близкое к «Физиологу» описание единорога можно найти у Василия Великого (ок. 530-79 гг. н.э.).
Цитируя отрывок из Книги Иова он замечает, что Христос «может быть назван Сыном единорогов, поскольку, как пишет Иов, единорог обладает неодолимой силой и человек не может его покорить». Рог в Библии часто означает блаженство и спасение: «Христос — сила Господа, поэтому он призвал единорога на землю, чтобы он был его горном, обладающим той же мощью, что и Бог-отец».
Таким образом, история единорога интерпретируется в средневековой литературе как история Христа - «Духовного единорога», воплотившегося в лоне Богоматери, взятого под стражу и осужденного на смерть. Его единственный рог означает здесь единство Христа с богом-отцом. В ХII веке идея о том, что пленение единорога представляет воплощение божества в Христе, трансформируется в законченную аллегорию Благовещения.
Различие между восточной и европейской версиями образа этого животного отчетливо было видно в отчете Марко Поло (1254 — 1524), который в своих путешествиях на Восток описал носорогов, увиденных на Суматре. Его рог сразу вызвал ассоциации с единорогом, поэтому он поспешил назвать это животное единорогом, но при этом отметил, что злобный и мерзкий зверь не имеет ничего общего с настоящим единорогом, который, согласно «нашим историям», может быть пойман при посредничестве непорочной девы.
К ХII веку в Европе получили распространение так называемые «бестиарии» — компиляции из таких источников, как «Физиолог» и «Этимологии» Исидора Севильского. Именно в них можно обнаружить законченную религиозную символику единорога.
Единорог теперь предстает существом гораздо меньшим по размеру, чем было описано у Ктесия или Плиния, у него появляются черты разных животных: козлиная борода, львиный хвост и раздвоенные копыта. Небольшой размер этого животного компенсировался быстротой, благодаря которой его невозможно было поймать. Особой популярностью единорог пользовался в Позднем Средневековье, как в качестве светского, так и религиозного символа.
Но наступившая эпоха Реформации и распространение нового, рационального знания поколебали прочность мифа. В 1563 году Триденский собор, который преобразовал средневековое мистическое богословие в авторитетную догму в свете распространявшегося Протестантизма, запретил использование единорога в качестве аллегории Благовещения в христианском искусстве. С этого момента единорог исчез из христианской символики, и в дальнейшем получил известность благодаря литературе, искусству, геральдике и медицине.