Наши бельгийские коллеги вновь подняли вопрос о улучшении раннего эмбрионального периода с помощью активации ооцитов. Достаточно интересная работа хоть и наполненная множеством специфических терминов и отсылкам к предыдущим исследованиям. Но хотелось оставить все эти оригинальности в переводе, лишь немного упростив некоторые термины. Спойлер писать не буду. Выводы в конце жирным шрифтом. Но и сама статья интересна для понимания того, насколько сложен процесс оплодотворения, и что мы пока, как и Сократ: "знаем, что ничего не знаем", а пока и не можем на что-либо серьезно повлиять
Введение
Высвобождение внутриклеточного кальция (Ca2+) в ооците является характерным событием во время оплодотворения млекопитающих. Точный паттерн Ca2+, индуцируемый во время оплодотворения, видоспецифичен, т.е индивидуален для каждого вида животных, и характеризуется частотой, амплитудой и продолжительностью выброса Ca2+ (Stein et al., 2020). Длительные осцилляции(выбросы) Ca2+ возникают сразу после того, как сперматозоиды доставляют белок фосфолипазы C дзета (PLCf) во время слияния гамет. Когда белок фосфолипазы C дзета (PLCf) присутствует в цитоплазме ооцита, он способствует выработке инозитол три фосфат (IP3), который стимулирует высвобождение Ca2+ через свой рецептор IP3R, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме ооцита (Kashir et al., 2010; Yeste et al. др., 2016). Свободные внутриклеточные молекулы Ca2+ активируют несколько киназ (ферментов) ооцитов в зависимости от времени, которые запускают все события, необходимые для завершения оплодотворения, включая экзоцитоз кортикальных гранул* , возобновление мейоза, экструзию второго полярного тельца, образование пронуклеусов и рекрутирование материнских мРНК (Ducibella et al. ., 2002; Штейн и др., 2020). Хотя для завершения этих событий требуется различное количество транзиентов Ca2+ (Ducibella et al., 2002), ооциты проявляют высокую степень толерантности к неправильным, изменным сигналам Ca2+ и могут также активироваться, когда общее количество высвобождаемого Ca2+ достигает минимального порога (Ozil et al., 2005; To´th et al., 2006). С другой стороны, сообщалось, что недостаточное или аномальное высвобождение Ca2þ вызывает низкий уровень оплодотворения или полный отказ от оплодотворения после ИКСИ (Yoon et al., 2008; Ferrer-Buitrago et al., 2018b), что может быть устранено с помощью вспомогательной активации ооцитов. (АОА) (Рыбушкин и др., 1997). С помощью вспомогательной активации ооцитов в цитоплазме ооцитов индуцируются искусственные колебания Са2+ с использованием в основном ионофоров Са2+ (иономицин или кальцимицин) (Vanden Meerschaut et al., 2014b). Эти ионофоры Ca2+, хотя и очень эффективны, индуцируют только один или два всплеска Ca2+ и, таким образом, не имитируют физиологический паттерн колебаний Ca2+, наблюдаемый при оплодотворении человека (Ferrer-Buitrago et al., 2018a). Вспомогательная активация ооцитов неоднократно применялась для восстановления сниженной частоты оплодотворения после ИКСИ (Bonte et al., 2019; Shan et al., 2022), что приводило к нормальному развитию эмбриона и здоровому живорождению (Vanden-Meerschaut et al., 2014a; Mateizel et al. ., 2018) и было показано, что он очень эффективен у пациентов с аномальным содержанием белка PLCf, у которых недостаточна адекватная динамика Ca2+ (Torra Massana et al., 2019; Meng et al., 2020; Mu et al., 2020).
Влияние недостаточных паттернов Ca2+ на преимплантационное эмбриональное развитие человека до сих пор не ясно. Некоторые исследования, проведенные на мышах и кроликах, показали, что сниженный или избыточный приток Ca2+ влияет как на до-, так и на постимплантационные события, а также на развитие до срока (Ozil and Huneau, 2001; Ozil et al., 2005, 2006). Поскольку эти исследования подчеркнули важность Ca2+ в событиях после оплодотворения, АОА была предложена в качестве возможного лечения для преодоления проблем развития эмбриона после ИКСИ (Ebner et al., 2015; Mateizel et al., 2022; Yin et al., 2022). ). В 2015 году Эбнер и соавт. (2015) сообщили о значительной пользе лечения вспомогательной активацией ооцитов для этих пар, поскольку частота бластоцист восстанавливалась до нормальных значений (50%). Кроме того, наблюдалось значительное увеличение показателей живорождения по сравнению с их предыдущими циклами ИКСИ без вспомогательной активации ооцитов (Ebner et al., 2015). Тем не менее, два более поздних исследования сиблингов ооцитов (имеется ввиду ооцитов полученных из одной когорты, одни обрабатывались ионофорами, другие нет) показали, что лечение вспомогательной активацией ооцитов не способно ни улучшить развитие эмбрионов, ни показатели живорождения в этой популяции пациентов (Mateizel et al., 2022; Yin et al., 2022). Важно подчеркнуть, что критерии включения «проблем развития эмбрионов после ИКСИ» различались между этими тремя исследованиями. В то время как Эбнер и соавт. (2015) включали пациентов с уменьшенным образованием бластоцист (15%), Yin et al. (2022) включали пациентов с низким уровнем эмбрионов 3-го дня (D3) хорошего качества (30%), а Mateizel et al. (2022) включали пациентов с низким уровнем эмбрионов хорошего качества на 5-й день (D5). Различия в критериях включения, а также в дизайне исследования и ионофоре Ca2+, используемом во время АОА, могут объяснить эти противоречивые результаты (Ebner and Shebl, 2022). Кроме того, ни в одном из этих исследований не изучалась основная причина проблем развития эмбриона, которые могли быть вызваны как факторами, связанными со сперматозоидами, так и факторами, связанными с ооцитами. В частности, было бы интересно узнать, индуцируется ли нормальная или нарушенная динамика Ca2+, связанная с оплодотворением, у пациентки, чтобы определить, будет ли вспомогательная активация ооцитов полезной.
Задержка развития эмбриона (EDA) — это термин, используемый для определения состояния многофакторного бесплодия, при котором развитие эмбриона останавливается на любой стадии развития (зигота, стадия дробления или морула) до достижения стадии бластоцисты (Mohebi and Ghafouri Fard, 2019; Sfakianoudis et al. ., 2021). В качестве альтернативы, эмбрионы некоторых пар могут достичь стадии бластоцисты, но с более низкими показателями успеха. Позднее состояние обычно описывается в категории «проблемы развития эмбриона» (Ebner et al., 2015; Ebner and Shebl, 2022; Mateizel et al., 2022; Yin et al., 2022). Эмбриональная остановка является частым явлением, наблюдаемым после ИКСИ, поскольку 40% от общей когорты зигот всегда останавливают развитие до достижения стадии бластоцисты (Sfakianoudis et al., 2021). Более того, у половины пациентов, получавших ИКСИ, в каждом цикле всегда обнаруживается один задержанный эмбрион (Mohebi and Ghafouri-Fard, 2019). Тем не менее, когда все эмбрионы обнаруживают задержку развития эмбриона, иногда во время повторных циклов, возможности лечения становятся очень ограниченными, и пациентам часто требуется донорство гамет.
До тех пор, пока не произойдет активация генома эмбриона (у человека между стадиями четырех- и восьмиклеточного развития), ранние расщепления почти исключительно зависят от белков и мРНК, происходящих из ооцитов, которые кодируются генами материнского эффекта (MEG) (Paonessa et al., 2021). ). Многие исследования мышей с нокаутом генов продемонстрировали возникновение остановки эмбриона на разных стадиях после вмешательства определенных генов материнского эффекта (Condic, 2016). Однако исследования на людях все еще ограничены, и только несколько генами материнского эффекта, образующих подкорковый материнский комплекс (SCMC), были связаны с задержками развития эмбриона (Paonessa et al., 2021). Подкорковый материнский комплекс представляет собой мультибелковый комплекс, состоящий как минимум из шести белков, который участвует в активации генома эмбриона и, таким образом, имеет решающее значение для правильного эмбрионального развития (Bebbere et al., 2016). Недавно у пациентов, страдающих задержками развития эмбриона, были обнаружены мутации в генах материнского эффекта, связанных с подкорковым материнским комплексом (TLE6, PADI6, NRLP2, NRLP5, NRLP7 и KDHC3L), демонстрирующие различную степень остановки эмбриона в зависимости от затронутого белка и типа мутации (Xu et al., 2016; Wang et al., 2018; Mu et al., 2019; Lin et al., 2020; Zheng et al., 2021).
Настоящее исследование было направлено на изучение того, может ли активация ооцтов с использованием иономицина решить проблемы развития эмбриона (образование 15% бластоцисты), поскольку в литературе представлены противоречивые результаты. Кроме того, чтобы лучше понять основную причину нарушения эмбрионального развития, наблюдаемого в нашей когорте пациентов, мы исследовали причину наблюдаемой задержки развития эмбриона. Во-первых, авторы изучили, способны ли сперматозоиды партнера-мужчины индуцировать нормальный паттерн Ca2+ во время оплодотворения с помощью анализа кальция ооцитов мышей (MOCA)*(см.внизу). Затем провели генетический скрининг женских компонентов подкоркового материнский комплекс (NLRP2, NLRP5, NLRP7, TLE6, PADI6, KHDC3L), которые имеют решающее значение для развития эмбриона, и белка фосфолипазы C дзета PLCZ1, чтобы исключить возможный мужской фактор.
ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ, ОБЪЕМ, ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ:
В этом проспективном когортном одноцентровом исследовании сравнивались
циклы ИКСИ-с активацией ооцитов ионофорами
и
предыдущие циклы ИКСИ у пар с нормальным уровнем оплодотворения (60%), но нарушением эмбрионального развития (образование бластоцисты в 15%) по крайней мере в двух предыдущих циклах ИКСИ.
Всего в исследование были включены 42 пары с проблемами развития эмбриона
УЧАСТНИКИ/МАТЕРИАЛЫ, ОБСТАНОВКА, МЕТОДЫ.
Из 42 включенных пар 17 подверглись циклу ИКСИ-с активацией ионофорами кальция, состоящему из инъекции CaCl2 и двойного воздействия иономицина.
1. Частота оплодотворения, развития бластоцисты, беременности и живорождения после ИКСИ-активации сравнивалась с предыдущими циклами ИКСИ.
2. Кроме того, паттерн кальция, индуцированный спермой пациента мужского пола, был исследован с помощью анализа кальция в ооцитах мыши.
3. Кроме того, все 42 пары прошли генетический скрининг. Пациенты женского пола были обследованы на наличие генов SCMC (TLE6, PADI6, NLRP2, NLRP5, NLRP7 и KHDC3L), а пациенты мужского пола были обследованы на наличие фактора активации сперматозоидов PLCZ1.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И РОЛЬ СЛУЧАЙНОСТИ:
Сравнили 17 циклов с активацией с 44 предыдущими циклами ИКСИ у той же когорты пациентов.
1.После активации
общая частота оплодотворения составила 68,95% (131/190),
частота развития бластоцисты - 13,74% (18/131),
частота наступления беременности - 29,41% (5/17),
частота живорождений - 23,53% ( 4/17),
что не отличалось от предыдущих циклов ИКСИ (76,25% (321/421, P-значение = 0,06); 9,35% (30/321, P-значение = 0,18), 25,00% (11/421, P-значение = 0,06); 44, значение P = 0,75) и 15,91% (7/44, значение P = 0,48) соответственно).
2.Анализ кальция (MOCA) показал, что сперма пациента индуцировала кальциевые паттерны, аналогичные контрольным образцам спермы, демонстрирующим нормальный потенциал развития эмбриона.
3. Генетический скрининг выявил 10 уникальных гетерозиготных вариантов (в NLRP2, NLRP5, NLRP7, TLE6 и PADI6) неопределенной значимости (VUS) у 14 женщин.
Вариант NLRP5 c.623-12_623-11insTTC (p.?) был идентифицирован у двух неродственных особей, а вариант NLRP2 c.1572T>C (p.Asp524=) был идентифицирован у четырех женщин.
! Интересно, что была идентифицирована ранее сообщавшаяся гомозиготную мутацию PLCZ1, c.1499C>T (p.Ser500Leu), у пациента мужского пола с нарушением эмбрионального развития, но без типичной неудачи оплодотворения!
Обсуждение
В этом исследовании авторы показали, что лечение активацией с использованием иономицина не улучшало преимплантационное развитие эмбриона и не улучшало клинические результаты в нашей когорте пациентов с повторяющимися проблемами развития эмбриона после ИКСИ (образование 15% бластоцисты) (таблица I). Нарушение развития эмбриона, не зависящее от плохого оплодотворения или изменчивости от цикла к циклу, было обеспечено нашими строгими критериями включения.
В настоящее время имеется множество доказательств того, что ИКСИ в сочетании с активацией ионофорами увеличивает частоту оплодотворения и, следовательно, образование бластоцист у пациентов с полной неудачей оплодотворения или низким уровнем оплодотворения (<33%) после ИКСИ (Bonte et al., 2019; Li et al., 2019). ; Шан и др., 2022). Обоснование успеха этого лечения заключается в том, что нарушение активации ооцитов (либо сперматозоидов, либо связанных с ооцитами) в основном вызвано дефицитом факторов сперматозоидов или ооцитов, участвующих в механизме высвобождения Ca2+, поэтому искусственная индукция колебаний Ca2+ во время оплодотворения помогает преодолеть эту проблему.
Точно так же, когда дефицит возникает в белках, действующих ниже колебаний Ca2+, активация ооцитов, вероятно, не приносит пользы (Sang et al., 2018; Cardona Barbera´n et al., 2020).
В последние годы активация ооцитов также предлагали парам с другими показаниями, такими как проблемы с развитием эмбриона после ИКСИ, независимо от состояния пациента с бесплодием (Ebner et al., 2015; Mateizel et al., 2022; Tsai et al., 2022). ; Yin et al., 2022), но также и для определенных групп пациентов с бесплодием, которые обычно страдают от неудач ЭКО, таких как сниженный овариальный резерв (Tsai et al., 2022), СПКЯ, первичная недостаточность яичников (POI), старший репродуктивный возраст и женское необъяснимое бесплодие среди прочего (Lv et al., 2020).
Однако польза активации ооцитов для лечения проблем развития эмбриона до сих пор не ясна, и в литературе приводятся противоречивые результаты (Ebner et al., 2015; Lv et al., 2020; Mateizel et al., 2022; Tsai et al., 2022; Yin). и др., 2022).
Эбнер и др. (2015) предложили использовать активацию ооцитов с кальцимицином (GM508 Cult-Active) для лечения 57 пар с частотой оплодотворения >30% и задержкой развития эмбриона (остановка развития, без переноса), полной задержкой развития (отсутствие морулы/бластоцисты на D5) или сниженным образованием бластоцисты ( 15%) как минимум в одном цикле ИКСИ. Гипотеза авторов была основана на различных сообщениях, показывающих корреляцию между клеточным делением и доступностью Ca2+ (Berridge, 1995) и сообщающих, что колебания Ca2+, обычно предшествующие митотическому делению, исчезают у эмбрионов с задержкой развития (Sousa et al., 1996). Более того, некоторые исследования, проведенные на животных моделях, также предполагают, что изменение Ca2+, высвобождаемого во время активации ооцитов, затрудняет как оплодотворение, так и развитие эмбриона (Ozil and Huneau, 2001; Ozil et al., 2005, 2006). Все эти данные, по-видимому, поддерживают использование активации для этих пар, и, согласно Ebner et al. (2015) показали очень значительное увеличение образования бластоцист во всех группах пациентов по сравнению с их предыдущим циклом ИКСИ. Кроме того, также сообщалось об увеличении частоты имплантации, клинической беременности и живорождения (Ebner et al., 2015).
Хотя Эбнер и соавт. (2015) показали многообещающие результаты, два более поздних исследования ооцитов одной когорты не смогли подтвердить пользу АОА для лечения проблем развития эмбриона (Mateizel et al., 2022 in et al., 2022). Инь и др. (2022) включали 140 пациентов с нормальной частотой оплодотворения >70%, но с частотой эмбрионов D3 хорошего качества 30% в предыдущих циклах ИКСИ.
После обработки ооциов иономицином не было замечено различий в дроблении, эмбрионах D3 хорошего качества и доступной частоте бластоцист между группами без активации и с активацией
Кроме того, активация ооцитов не влияла на частоту имплантации, выкидышей, клинической беременности и живорождения (Yin et al., 2022). Матейзель и др. (2022) включали 19 пациентов с частотой оплодотворения >30% и плохим качеством эмбриона D5 по крайней мере в одном предыдущем цикле ИКСИ. В последующем цикле обработка ооцитов кальцимицином (GM508 Cult-Active) не увеличивала оплодотворение, хорошее качество эмбрионов D5 или коэффициент использования по сравнению с контрольной группой ооцитов без активации (Mateizel et al., 2022). Несмотря на то, что эти два исследования отличались критериями включения и ионофором Ca2+, выбранным для активации ооцитов, использование ооцитов этой же когорты в качестве контрольной группы обеспечивает более объективный набор данных для оценки эффекта активации, чем сравнение результатов активации с предыдущими циклами ИКСИ, выполненными Эбнер и др. (2015) и в его исследовании.
Тем не менее, мы убедились, что у всех пациентов было по крайней мере два цикла ИКСИ, показывающих проблемы развития эмбриона, в то время как Ebner et al. (2015) сравнили цикл ИКСИ- с активацией с непосредственно предшествующим ему циклом ИКСИ, независимо от наличия у пациентов более одного цикла ИКСИ с нарушением эмбрионального развития. В то время как у 23 из 57 пациентов, включенных в это исследование, было более одного цикла ИКСИ с аномальным развитием эмбриона, у 34 пар пациентов был только один неудачный цикл ИКСИ (Ebner et al., 2015). Последняя группа, возможно, внесла некоторую предвзятость, поскольку между циклами существует разница в качестве гамет.
Кроме того, ранее мы сообщали, что кальцимицин (GM508 Cult-Active) демонстрирует меньший потенциал высвобождения кальция и оплодотворения, чем иономицин, как в ооцитах мыши, так и человека (Nikiforaki et al., 2016). Примечательно, что скорость активации в ооцитах мыши и человека была очень низкой (<15%) после обработки кальцимицином (Nikiforaki et al., 2016). Кроме того, также сообщалось, что у пациентов с неудачей оплодотворения после ИКСИ с активацией при использовании иономицина дает более высокую активацию, чем при использовании кальцимицина (Jia et al., 2023), и что неудачные циклы ИКСИ-активацией с использованием кальцимицина можно восстановить с помощью иономицина. Эбнер и др., 2021). Последнее можно объяснить тем, что некоторым пациентам может потребоваться больше потенциальных стимулов, чем другим (Ebner and Shebl, 2022). Учитывая это, наше исследование согласуется с Yin et al. (2022) и Mateizel et al. (2022) и сообщает новые ценные данные о неэффективности лечения иономицином при оплодотворении для улучшения развития эмбриона.
В некоторых статьях также изучалось влияние активации на конкретные состояния бесплодия, которые могут привести к неудаче ЭКО из-за плохого качества эмбриона. Цай и др. (2022) сообщили об увеличении скорости дробления и хорошего качества эмбрионов D3 после ИКСИ-с активацией по сравнению с ИКСИ у пациенток со сниженным овариальным резервом в возрасте 40 лет, которые соответствовали критериям группы 4 POSEIDON (Возраст пациентов ≥ 35 лет с сниженным овариальным резервом КАФ < 5 ; АМГ < 1,2 нг/мл ожидаемый бедный ответ) (Tsai et al., 2022). Кроме того, Lv и соавт. (2020) лечили пациентов с различными показаниями к бесплодию (мужское бесплодие, вызванное олигоастенотератозооспермией (ОАТ), женское бесплодие, вызванное старшим репродуктивным возрастом, невыясненной причиной, СПКЯ, ПНЯ или сочетанием мужских и женских факторов) и отметили, что более высокая рождаемость была получена во всех группах, за исключением преждевременной недостаточности яичников после использования активации ооцитов, но частота бластоцист улучшилась только в группе олигоастенотератозооспермии, необъяснимого женского бесплодия и комбинированного мужского и женского бесплодия (Lv et al., 2020). Хотя активация ооцитов кажется полезной для некоторых из этих групп пациентов, общая начальная частота дробления и бластоцист, полученная после ИКСИ в обоих исследованиях, уже была высокой (Lv et al., 2020; Tsai et al., 2022), что может поставить под сомнение необходимость активации оооцитов для лечения этих групп пациентов.
Недавно был зарегистрирован случай с остановкой PN эмбриона после образования 2PN , которому помогло более позднее применение активации (Xi et al., 2020). Высвобождения кальция во время оплодотворения у этого эмбриона было достаточно, чтобы вызвать образование PN, но не хватило, чтобы способствовать первому митотическому расщеплению. Позднее применение ионофора во время остановки эмбриона (день 2) восстановило митотическую активность, затем были получены бластоцисты хорошего качества и было достигнуто живорождение (Xi et al., 2020). Для пациентов с успешным оплодотворением, но более поздней остановкой развития, применение активации во время задержки, делает лечение индивидуальным для каждого пациента, может быть лучшей стратегией восстановления развития эмбриона (Sousa et al., 1996; Ebner and Shebl, 2022). Изучение того, имеют ли пациенты с проблемами развития эмбриона дефицит кальция во время первых стадий дробления, расширит наши знания о динамике кальция во время эмбрионального развития и поможет определить конкретные группы пациентов, которые могут получить пользу от более позднего использования ионофоров кальция. Как упоминалось ранее, активация ионофорами теоретически принесет пользу только пациентам, страдающим дефицитом Ca2+.
Таким образом, авторы впервые также исследовали, способна ли сперма партнера-мужчины в парах с проблемами развития эмбриона индуцировать нормальные колебательные паттерны Ca2+ во время активации ооцитов. Все образцы спермы (кроме образца P13) показали высокую частоту всплесков Ca2+ и показатели AxF, сходные с контрольным образцом при инъекции в ооциты мыши (МОСА) (рис. 1) (VandenMeerschaut et al., 2013), что означает, что проблемы развития эмбриона, наблюдаемые в нашей когорте пациентов, могли быть вызваны факторами, связанными с ооцитами, которые не могут быть восстановлены с помощью активации ионофорами. Все эксперименты МОСА проводились с образцами замороженно-размороженной спермы из практических соображений, и хотя свежая сперма использовалась для всех циклов ИКСИ, предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории, подтвердили, что замороженно-размороженной сперма человека дает сравнимые паттерны колебаний кальция, как и свежая сперма (Vanden-Meerschaut et al. др., 2013). Кроме того, использование метода всплывания для обработки спермы во время МОСА было предпочтительным, поскольку это более быстрый метод, чем центрифугирование в градиенте плотности. Из литературы сообщалось, что нет никакой разницы в частоте оплодотворения и, следовательно, в способности высвобождать кальций при использовании образцов спермы, обработанных центрифугированием в градиенте плотности или методом прямого погружения (Palini et al., 2017). Кроме того, было показано, что содержание PLCf снижается после криоконсервации (Moreau et al., 2019), но даже несмотря на то, что результаты MOCA могут показать незначительное снижение высвобождения кальция по сравнению с ситуацией, в которой используется свежая сперма, криоконсервированны-размороженные образцы сравнивали с размороженными контрольными образцами с нормальным оплодотворением и развитием эмбриона, и при этом результаты не показали признаков дефицита кальция.
Нормальное высвобождение Ca2+ ожидалось от всех пациентов, включенных в исследование, поскольку мы исключили пациентов с частотой оплодотворения <60%, как и Yin et al. (2022). Тем не менее, мы обнаружили одного пациента (P13), который, хотя и имел нормальное оплодотворение (93,75%), показал высокую долю ооцитов с пиками 0 или 1-2 Ca2+ и, следовательно, имел самый низкий показатель AxF (24,1 AU). Этот больной страдал астенозооспермией, но тест на жизнеспособность выявил 59% живых сперматозоидов. Во время лечения ICSI и ICSI-с активацией тест HOS проводился для обеспечения инъекции живой спермы, о чем свидетельствуют высокие показатели оплодотворения, наблюдаемые у этого пациента. Тест HOS оценивает целостность мембран сперматозоидов в гипоосмотических условиях. Живые сперматозоиды в гипоосмотической среде контролируют осмотическое давление за счет набухания, в то время как мертвые сперматозоиды не могут его контролировать и набухают до тех пор, пока мембрана не разрушится (Ramu and Jeyendran, 2013). Преимущество этого теста в том, что живые сперматозоиды идентифицируются по набухшему хвостику и все еще могут быть использованы для ИКСИ.
Мы не могли выполнить этот тест до MOCA, что объясняет, почему в некоторых ооцитах не было высвобождения кальция. P13 показал значительное улучшение частоты бластоцист, увеличившись с 6,67% (1/15) после ИКСИ до 40,0% (4/10) после лечения ИКСИ-с активацией (таблица II).
Однако у этой пары не было бластоцист хорошего качества ни после ИКСИ (0,0%, 0/15), ни после ИКСИ-с активацией (0,0%, 0/10).
Проблемы развития эмбриона после ИКСИ могут быть вызваны целым рядом факторов (Mohebi and Ghafouri-Fard, 2019; Paonessa et al., 2021; Sfakianoudis et al., 2021). Недавние исследования выявили важную роль, которую подкорковый материнский комплекс играет во время первого дробления эмбриона (Bebbere et al., 2016), поскольку у разных пациентов, страдающих проблемами развития эмбриона, были обнаружены варианты генов подкоркового материнского комплекса (Xu et al., 2016). ; Wang et al., 2018; Mu et al., 2019; Lin et al., 2020; Zheng et al., 2021). В этой статье авторы также исследовали основные генетические причины проблем развития эмбрионов, наблюдаемых в их когорте пациентов, путем скрининга генетических вариантов в компонентах женского подкоркового материнского комплекса (TLE6, PADI6, NRLP2, NRLP5, NRLP7 и
KDHC3L9) и PLCZ1, чтобы исключить возможный мужской фактор. Никаких основных патогенных вариантов (классы 4 и 5) обнаружено не было, но мы обнаружили некоторые VUS (класс 3) в генах подкоркового материнского комплекса (таблица III). Классификация вариантов была выполнена с использованием платформы Varsome, поисковой системы, которая объединяет информацию из более чем 130 геномных баз данных и комбинирует различные типы данных (например, вычислительные, прогностические, функциональные, популяционные, сегрегационные) для классификации генетических вариантов человека в соответствии с рекомендациями ACMG. (Копанос и др., 2019). Varsome регулярно обновляется, уточняется и оценивается, поэтому классификация вариантов может меняться в зависимости от момента консультации.
На момент консультации мы выявили 10 гетерозиготных вариантов VUS. Следует отметить вариант TLE6 c.1100C>T (p.Pro367Leu), обнаруженный в P4, который, по прогнозам всех инструментов прогнозирования патогенности in silico, является повреждающим и обнаруживается с очень низкой частотой в общей популяции (таблица II). Этот вариант присутствует в одном из 7 доменов повторов бета-трансдуцина (WD-домены), которые содержит TLE6, и необходим для взаимодействия с белками. Все болезнетворные варианты, о которых сообщается в TLE6, расположены в доменах повторов WD белка, что делает весьма вероятным, что этот вариант также является причинным (Alazami et al., 2015; Lin et al., 2020). Кроме того, лечениеактивацией не было способно преодолеть нарушение эмбрионального развития, наблюдаемое после ИКСИ (дополнительная таблица SII), а также показатели эмбрионов D3 (59,1%, 13/22) и образования бластоцист (9,1%, 2/22), а также Эмбрион D3 хорошего качества (18,2%, 4/22) и формирование бластоцисты хорошего качества
(0,0%, 0/22) показатели оставались очень низкими (таблица II). Этот результат согласуется с тем фактом, что сперма партнера-мужчины смогла вызвать нормальное высвобождение Са2+ (рис. 1). Тем не менее, необходимо провести тесты функционального анализа, чтобы оценить причинно-следственную связь вариантов, о которых сообщается в этой статье. Для оценки патогенности вариантов подкоркового материнского комплекса можно применять несколько стратегий: иммуноокрашивание специфического белка в неоплодотворенных или задержанных эмбрионах пациента (Xu et al., 2016), сравнение уровней белка после трансфекции клеток Hela комплементарной РНК (кРНК) конструкции, содержащие интересующий белок с мутацией и без нее (Mu et al., 2019), а также получение моделей мышей, несущих вариант (Yu et al., 2014).
Все варианты подкоркового материнского комплекса, о которых сообщалось в литературе, идентифицированы в гомозиготном или сложном гетерозиготном состоянии, в отличие от результатов, полученных в этой статье (Alazami et al., 2015; Xu et al., 2016). Поскольку были секвенированы только экзонных и фланкирующие интронные области, могут быть варианты, вызывающие заболевание, в других интронных областях, таких как промоторы или энхансеры, которые не были обнаружены. Мы не можем исключить возможность того, что другие гетерозиготные варианты присутствуют в неоткрытых генах, также участвующих в ранних преимплантационных эмбриональных делениях. В последние годы мутации в других женских генах, участвующих в остановке созревания ооцитов, таких как PATL2 и TUBB8, также были обнаружены у пациенток с задержками эмбрионального развития (Chen et al., 2017; Wu et al., 2019), что означает, что другие белки, участвующие в важных путях, происходящие до эмбрионального развития, такие как созревание ооцитов и оплодотворение, могут оказывать более позднее влияние на развитие эмбриона. Наконец, частота обнаружения мутаций подкоркового материнского комплекса, о которых сообщается в литературе, довольно низкая (Mu et al., 2019; Lin et al., 2020). Например, Лин и др. (2020) обнаружили мутации TLE6 только у 3/403 обследованных лиц. Более того, многие мутации в подкорковом материнском комплексе были выявлены у пациентов из кровнородственных семей, которые имеют повышенный риск рецессивных генетических нарушений (Xu et al., 2016; Wang et al., 2018; Zheng et al., 2021). Кровное родство более распространено на севере и в странах Африки к югу от Сахары, на Ближнем Востоке, в Центральной и Южной Азии (Bittles and Black, 2010). Это может объяснить, почему мы не идентифицировали какой-либо явный патогенный вариант при скрининге 42 пациентов европеоидной расы. Наконец, целенаправленный генетический скрининг кажется недостаточным для выявления патогенных мутаций, вызывающих нарушение эмбрионального развития, поскольку это многофакторное состояние, при котором многие необходимые молекулярные факторы еще не обнаружены. Лучшей стратегией было бы секвенирование всего экзома или всего генома, хотя эти методы более дороги и требуют сложного биоинформатического анализа (Capalbo et al., 2021).
Неожиданно мы обнаружили гомозиготную мутацию в PLCZ1 (c.1499C>T; p.Ser500Leu), о которой ранее сообщалось, что она вызывает отсутствтие оплодотворения после ИКСИ у 9 из 37 пациентов, прошедших скрининг в рамках одного исследования (TorraMassana et al., 2019). Функциональный анализ не выявил снижения скорости оплодотворения после инъекции ооцитов IVM человека с мутированной кРНК PLCZ1 p.Ser500Leu по сравнению с кРНК PLCZ1 дикого типа (WT) (Torra-Massana et al., 2019). Этот результат может частично объяснить фенотип, наблюдаемый в P35, поскольку у этой пары была нормальная частота оплодотворения после обычного ИКСИ (74,07%), но все эмбрионы остановились до достижения состояния бластоцисты (дополнительная таблица SIII). Дальнейшие исследования должны выяснить, способны ли сперматозоиды с кРНК PLCZ1 p.Ser500Leu поддерживать развитие эмбриона до стадии бластоцисты, как это делает кРНК PLCZ1 WT в ооцитах мышей (Saunders et al., 2002). Более того, активация ооцитов смогла восстановить показатели оплодотворения у этих пациентов, независимо от того, находилась ли мутация PLCZ1 c.1499C>T (p.Ser500Leu) в гетерозиготном или гомозиготном состоянии, и были достигнуты живорождения (Torra-Massana et al., 2019). . К сожалению, Р35 еще не прошел цикл ИКСИ-с активацией. Активация, скорее всего, преодолеет нарушение развития эмбриона, поскольку оно, по-видимому, вызвано дефицитом PLCf. Более того, для подтверждения причинно-следственной связи варианта PLCZ1 еще предстоит изучить паттерн высвобождения Ca2+, индуцированный образцом спермы пациента.
В заключение, наши данные показывают, что лечение активацией ооцитов не показано для пациентов с проблемами развития эмбриона в анамнезе после ИКСИ (образование бластоцисты в 15 %), поскольку это, вероятно, является результатом факторов, связанных с ооцитами, не связанных с нарушенными паттернами Ca2+. Несмотря на небольшой размер выборки, мы решили прекратить исследование и не включать больше пациентов, так как после ИКСИ-с активацией не наблюдалось положительного эффекта. Кроме того, в литературе мало данных, подтверждающих прямую пользу лечения активацией ооцитов для пар, страдающих этим заболеванием.
Кроме того, в литературе мало данных, подтверждающих прямую пользу использования активации ооцитов для пар, страдающих этим заболеванием. Кроме того, гетерогенность пациентов усложняет сравнение результатов этих исследований и выявляет необходимость строгого определения проблем развития эмбриона для уменьшения чрезмерного использования активации ооцитов. Хотя у детей, рожденных после ИКСИ-активация ооцитов, серьезных аномалий обнаружено не было (Vanden-Meerschaut et al., 2014a; Mateizel et al., 2018; Shan et al., 2022), этот метод следует зарезервировать для пар с явным дефицитом в динамике Ca2+ ооцитов после оплодотворения (Ferrer-Buitrago et al., 2018b; Cardona Barbera´n et al., 2020). Кроме того, мы также описали различные гетерозиготные варианты подкоркового материнского комплекса VUS у пациентов с проблемами развития эмбриона; тем не менее, причинно-следственная связь должна определяться функциональной оценкой. Также еще предстоит выяснить, могут ли варианты PLCZ1 вызывать как нарушение оплодотворения, так и фенотипы бесплодия с задержкой развития эмбрионов. Наконец, генетический скрининг с использованием методов полноэкзомного секвенирования может выявить новые гены и варианты, участвующие в развитии эмбриона, и позволить разработать более подходящие и персонализированные варианты лечения для этих пар. Для пациентов с явными молекулярными дефектами инъекция кРНК WT или рекомбинантного белка во время ИКСИ может восстановить аномальное содержание белка и обеспечить правильное эмбриональное развитие. Введение WEE2, TRIP13, и молекулы кРНК CDC20 WT у пациентов с соответствующими мутация может восстановить созревание ооцитов и потенциал оплодотворения (Санг и др., 2018 г.; Чжан и др., 2020 г.; Чжао и др., 2020 г.). Для пациентов с явными молекулярными дефектами и без них, но все же с подозрением на цитоплазматический дефицит ооцитов, ядерный перенос (NT) может представлять собой основной подход. Ядерный перенос состоит в замене низкокачественной цитоплазмы ооцита или зиготы (содержащей аномальные белки, необходимые для оплодотворения и/или развития эмбриона) цитоплазмой хорошего качества из здорового ооцита или зиготы (Craven et al., 2017). Недавно с использованием мышиной модели остановки эмбриона было показано, что ядерный перенос значительно увеличивает скорость образования бластоцист (Costa-Borges et al., 2020; Tang et al., 2020).
Более того, у людей уже было предложено использовать ядерный перенос для преодоления задержки развития эмбриона (Zhang et al., 2016), а также отсутствие оплодотворения после ICSI-с активацией
КРАТКИЙ ОТВЕТ: Активация ооцитов не улучшала формирование бластоцисты в нашей когорте пациентов с рецидивирующими проблемами развития эмбриона после ИКСИ
*экзоцитоз кортикальных гранул* (это собой фундаментальный процесс, при котором кортикальные гранулы сливаются с плазматической мембраной после оплодотворения спермы, предотвращая полиспермию и обеспечивая развитие эмбриона)
*процедура МОСА
МОСА выполняли, как описано ранее (Vanden-Meerschautv et al., 2013). Ооциты метафазы II (MII) собирали у самок мышей B6D2F1 в возрасте от 8 до 12 недель (Janvier Labs, Франция) через 12–14 ч после введения чХГ и культивировали в безбелковой среде в стандартных условиях (37°С в 6% СО2 и 5% О2). Замороженную и нагретую сперму пациента и контрольную группу промывали центрифугированием с использованием буфера. Мышиные ооциты предварительно загружали в Са2+-чувствительнsq краситель.
Подвижные сперматозоиды отбирали после всплытия и немедленно микроинъецировали в ооциты мыши MII с помощью пьезоэлектрических импульсов. В течение 30 мин после первой микроинъекции ооциты помещали в среду. Визуализация Ca2+: изображения получали каждые 5 с в течение 2 часов. Все паттерны Ca2+ анализировали с использованием программного обеспечения. Общее количество высвобождаемого Са2+ рассчитывали как произведение средней амплитуды (А) на среднюю частоту (F) всех инъекций ооцитов на пациента (по крайней мере, из 15 выживших ооцитов). Оценка AxF была описана ранее для выявления дефицита активации ооцитов в сперме пациентов с низкой или полной неудачей оплодотворения после ИКСИ (Vanden Meerschaut et al., 2013). Баллы AxF 9 указывают на недостатки, связанные со сперматозоидами во время активации ооцитов, тогда как баллы AxF> 9 исключают это вовлечение
