Метод Кьельдаля используется во всем мире как стандарт для анализа содержания азота и белка в продуктах питания, кормах, ингредиентах кормов и напитках. Наиболее часто проводимые анализы — это белок кукурузы, ячменя, пшеницы, семян, а также белок в молоке, пиве, печенье, колбасах, мясе и муке.
Определение
Это метод быстрого измерения пропорций азота в органическом соединении, названный в честь датского химика Йохана КЬЕЛЬДАЛЯ (1849-1900). В выборочной партии азот при нагревании органического вещества с концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора переходит в сульфат аммония. После добавления гидрата окиси натрия вся смесь кипит, высвобождая аммиак. Он растворяется в кислоте, и аммиак, а значит и азот, определяется ТИТРОВАНИЕМ.
Датский химик Йохан Кьельдаль создал метод определения общего азота ещё в 1883 году. Все усовершенствования направлены на ускорение процесса (в основном на подбор новых нетоксичных катализаторов) и автоматизацию стадий. Метод обладал несомненными преимуществами: был прост в исполнении, не требовал много времени, дорогих реактивов и приспособлений для анализа, показывал точные и воспроизводимые результаты. Со временем изобретенный Кьельдалем метод стал эталонным для анализа содержания белка. Этапы метода Кьельдаля с тех пор не изменились, однако существенно преобразился способ анализа. Развитие технологий позволило усовершенствовать и полностью автоматизировать процессы, ранее выполняемые вручную. Автоматические приборы для определения белка по Кьельдалю позволяют значительно уменьшить влияние человеческого фактора, обеспечивают высокий уровень точности результатов и безопасность работы для операторов.
Сущность метода Кьельдаля
Заключается в переводе органического азота в аммонийную форму, в процессе термического разложения образца с кислотой, дальнейшая дистилляция полученной смеси со щелочью для перевода аммонийного азота в аммиак, поглощение аммиака водным раствором и титрование полученного раствора. Метод Кьельдаля является универсальным и используется для определения содержания азота в пищевых и фармацевтических продуктах, текстиле, полимерах, объектах окружающей среды и т.д.
Следует различать понятия общий азот по Кьельдалю и общий азот. Общий азот по Кьельдалю обозначается TKN (Total Kjeldahl Nitrogen) и представляет собой сумму органических форм азота и аммонийного азота. При анализе почв и сточных вод помимо органического и аммонийного азота также будет учитываться аммиачный азот.
Азот содержащейся в виде нитратов и нитритов при анализе по методу Кьельдаля не учитывается. Общее содержание азота во всех органических и неорганических формах обозначается TN (Total Nitrogen) и определяется как сумма азота по Кьельдалю и азота в форме нитратов и нитритов.
Органический азот гетероциклических соединений при разложении по Кьельдалю не переходит в аммонийную форму, поэтому образцы с гетероциклами азота не исследуют методом Кьельдаля.
Этапы проведения анализа по методу Кьельдаля
Первый этап. Происходит минерализация (разложение) пробы образца концентрированной серной кислотой в присутствии окислителя, инертной соли — сульфата калия и катализатора — сульфата меди. При этом аминогруппы белка превращаются в сульфат аммония, растворенный в серной кислоте. Данный этап является самым трудоемким и продолжительным (более часа). В классическом методе разложение проводят в круглодонных колбах помещенных в песчаную баню или колбонагреватель. Кьельдаль использовал для разложения круглодонные колбы с длинным горлом, позже их стали именовать колбами Кьельдаля.
CHNO + H2SO4→ H2O + CO2 + SO2 + (NH4)2SO4
Цель процедуры разложения — разорвать все азотные связи в образце и преобразовать весь органически связанный азот в ионы аммония (NH4+). В оригинальном методе Кьельдаля образец смешивают с серной кислотой и кипятят при температуре от 350 до 380 °C в течение нескольких часов. Скорость минерализации может быть значительно увеличена добавлением солей калия или натрия и катализаторов. Сульфат калия добавляется для повышения температуры кипения серной кислоты, а катализаторы ускоряют окисление. Использование катализатора позволяет повысить температуру до 420 ºC, сокращая время разложения примерно до одного часа. Большинство лабораторий используют предварительно приготовленные таблетки катализатора Кьельдаля, чтобы сэкономить время и снизить риск ошибок. Как правило, таблетка содержит 97–99 % соли и 1–3 % катализатора или смеси катализаторов (соли меди, соединения селена, оксид титана и др.), а также дополнительные компоненты для предотвращения вспенивания.
Реализация первого этапа исследования происходит с помощью дигестора — блока озоления пробы.
Второй этап. Происходит реакция связанного азота с избытком сильного основания (NaOH), в результате чего образуется аммиак, подщелачивания раствора, дистилляции аммиака с водяным паром, поглощения его раствором борной кислоты. Реализация второго этапа происходит с помощью полуавтоматического или автоматического блока дистилляции. При использовании автоматического анализатора протеина P110 ERKAYA оператору остается только оттитровать готовый раствор
В процессе минерализации образуется раствор сульфата аммония, который необходимо превратить в свободный аммиак. Для этого используется реакция с концентрированной щелочью. Полученный в результате аммиак отгоняют с помощью дистилляции с водяным паром в приемник с кислотой.
Третий, последний этап анализа — титрование раствором соляной кислоты с индикацией точки эквивалентности по изменению окраски индикатора (ручное титрование) или с помощью потенциометрического анализатора (ручное или автоматическое титрование).
Количественное определение выделившегося аммиака проводится с помощью колориметрического или потенциометрического титрования. Как правило, если в приемнике для аммиака находится слабая кислота (борная), то титрование проводят сильной кислотой — соляной или серной. Если аммиак отгоняют в сильную кислоту (HCl или H2SO4), ее избыток титруют сильным основанием (раствором NaOH).
После завершения титрования рассчитывают массу азота в анализируемом образце.
Прямое титрование mN = ((Vобр – Vхол) * СHCl * TITER * 14) / 1000
Обратное титрование mN = ((Vхол – Vобр) * СNaOH * TITER * 14) / 1000
Расчет белка по методу Кьельдаля
Органически связанный азот содержится в белках, аминокислотах, нуклеиновых кислотах и играет важную роль в метаболизме живых организмов. Содержание азота в различных индивидуальных молекулах белка колеблется в диапазоне от 14 до 19%. Обычно при пересчете содержания азота в содержание белка используется усредненное содержание азота в белке – 16 %. Таким образом, коэффициент пересчета на белок равен 100/16=6,25.
В некоторых продуктах питания преобладают белки определенного типа, для них определены другие коэффициенты пересчета.
Стандарты метода Кьельдаля
Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля приведены в ГОСТ 26889-86 (он до сих пор действующий, последняя редакция была 1 марта 2010 года). В нём приведены рекомендации по проведению анализа, но указано, что отдельные моменты могут быть приведены в более специализированных стандартах.
- ГОСТ 34454-2018 распространяется на молочную продукцию (молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты, молокосодержащие продукты с заменителем молочного жира) и устанавливает определение массовой доли общего белка.
- ГОСТ 34536-2019 распространяется на молоко и молочную продукцию (сырое молоко, питьевое молоко, сырые сливки, питьевые сливки, концентраты сывороточных белков) и устанавливает определение массовой доли сывороточных белков.
- ГОСТ 25011-2017 распространяется на мясо и мясные продукты (включая мясо птицы, мясные и мясосодержащие продукты) и устанавливает методы определения массовой доли белка.
- ГОСТ 34111-2017 распространяется на фруктовые и овощные соки (в том числе концентрированные, нектары, сокосодержащие напитки) и устанавливает метод определения массовой доли азота.
- ГОСТ Р 54662-2011 распространяется на сыры, сырные массы и плавленые сыры и устанавливает определение массовой доли белка.
- ГОСТ 10846-91 распространяется на зерно и продукты его переработки и устанавливает метод определения белка.
- ГОСТ 13496.4-2019 и ГОСТ 32044.1-2012 распространяются на корма, комбикорма и комбикормовое сырьё и устанавливают методы определения азота с последующим пересчётом результатов на сырой протеин.
- Фармакопея XIV издание (раздел ОФС.1.2.3.0011.15) распространяется на лекарственные средства и устанавливает определение массовой доли азота.
Р110 ERKAYA (Аппарат Кьельдаля) — автоматический анализатор протеина в новом усовершенствованном дизайне от ведущего турецкого производителя компании ERKAYA Laboratory Instruments and Flour Improvers Co. Ltd
Приборы ERKAYA, это полная гарантия, бесплатная доставка, цена от завода-производителя. Мы поможем запустить оборудование, обучим персонал и окажем профессиональную информационную поддержку на всех этапах работы.
Заказать оригинальное оборудование бренда ERKAYA можно только у сертифицированного дилера «КОЛБА», единственного представителя компании Erkaya Instruments на территории России.