Неинвазивное преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (niPGT-A) позволяет избежать возможного вредного воздействия инвазивного PGT-A на развитие эмбриона и клинические исходы. Отражает ли бесклеточная ДНК (вкДНК) из отработанной среды для культивирования бластоцисты (BCM) хромосомный статус эмбриона лучше, чем биопсия трофэктодермы (TE)?
Результаты опубликованы в статье
Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) на хромосомные аномалии эмбрионов значительно улучшило клинические результаты ЭКО (Cimadomo et al., 2020). Биопсия трофэктодермы (ТЭ) как широко используемый инвазивный метод отбора проб для ПГТ имеет несколько недостатков, которые необходимо устранить. Квалифицированный эмбриолог должен собрать от четырех до восьми клеток из TE с помощью специального оборудования, что может повредить жизнеспособности и потенциалу развития эмбриона, подлежащего переносу (Makhijani et al., 2021; Tiegs et al., 2021; Zhang et al., 2019). Более того, биопсия TE не всегда точно отражает эмбриональный статус при наличии мозаицизма (Popovic et al., 2020).
Из-за опасений по поводу безопасности и точности инвазивных биопсий предпринимаются попытки заменить их неинвазивным преимплантационным генетическим тестированием на анеуплоидии (niPGT-A). Бесклеточная ДНК (cfDNA) присутствует в отработанной культуральной среде бластоцисты (BCM), и успешный niPGT-A был впервые достигнут с использованием двух высококачественных отработанных образцов бесклеточной ДНК в отработанной культуральной среде (Stigliani et al., 2013).
В нескольких исследованиях оценивалась клиническая полезность niPGT-A путем сравнения ее результатов с биопсией трофэктодермы в качестве золотого стандарта. Неудивительно, что эти исследования сделали противоречивые выводы. Похоже, что niPGT-A имеет аналогичную или сопоставимую эффективность по сравнению с биопсией TE (Chen et al., 2021; Rubio et al., 2019, 2020; Shitara et al., 2021; Xu et al., 2016). Проблема заключается в том, что показатель успеха niPGT-A для амплификации ДНК (63,0%) низок, а хромосомная дискордантность высока (40,4%) (Hanson et al., 2021). Таким образом, еще предстоит окончательно определить, превосходит ли niPGT-A биопсию трофэктодермы
Бесклеточная ДНК в отработанной культуральной среде, где культивировалась бластоциста, возникает в результате апоптоза клеток как в TE, так и во внутренней клеточной массе (ICM) с различным процентным содержанием загрязняющей материнской ДНК (Bolton et al., 2016; Chen et al., 2021; Hardy, 1999). Теоретически это лучший индикатор всего эмбриона, чем биопсия TE, если загрязнение материнской ДНК низкое. Соответственно, niPGT-A должен иметь более высокую согласованность с PGT-A ICM или остаточной бластоцисты (RB) (бластоциста с удаленной большей частью ICM), чем биопсия TE.
Предыдущие исследования не смогли подтвердить это, потому что они либо использовали донорские бластоцисты, которые витрифицируются на 5/6 день, что означает, что вкДНК будет накапливаться к 6/7 дню; они использовали донорские бластоцисты с диагнозом анеуплоидия; или они использовали только ICM или смесь ICM с TE (Chen et al., 2021; Huang et al., 2019; Li et al., 2021; Rubio et al., 2019, 2020). В этом исследовании TE-биопсия, ICM, RB и отработанная BCM каждого из 35 донорских эмбрионов были взяты отдельно для исследования (РИСУНОК 1), и результаты тестирования хромосомного статуса сравнивались между этими группами.
Обсуждение
В этой работе впервые было проведено систематическое сравнение результатов генетического тестирования биоптатов трофэктодермы, внутренней клеточной массы, остаточная бластоциста и культуральной среды для бластоцисты, отобранных из одних и тех же эмбрионов. Хотя образцы были взяты в разные дни (21 эмбрион на 5-й день и 14 эмбрионов на 6-й день), не было выявлено существенных различий в плоидности хромосом между образцами двух групп эмбрионов. Было обнаружено, что биопсия трофэктодермы по-прежнему дает лучшие результаты, чем обработка бесклеточной ДНК из отработанной культуральной среды для бластоцисты, по всем трем критериям (хромосомная плоидность, диагностическая и половая конкордансность). Неожиданно биопсия трофэктодермы также имела более высокую конкордантность при тестировании с остаточной бластоцистой; по тем же критериям, чем обработка бесклеточной ДНК из отработанной культуральной среды для бластоцисты. Предполагается, что загрязнение материнской ДНК является основной причиной этих результатов, поскольку самый высокий процент несоответствия пола был обнаружен при использовании отработанной культуральной среды для бластоцисты. Напротив, в биопсиях трофэктодермы не было обнаружено половой дискордантности.
Определение соответствия оказывает важное влияние на оценку клинической значимости niPGT-A. Информативные профили генетического тестирования включают четыре типа результатов: эуплоидный, хромосомный анеуплоидный, CNV* и мозаичный.
В этом исследовании были даны два определения конкордантности:
- конкордантность хромосомной плоидности придерживается строгого стандарта, который учитывает все хромосомные аномалии (анеуплоидные, CNV и мозаичные) при расчете;
- диагностическое соответствие содержит гибкий стандарт, который принимает во внимание анеуплоид и CNV, но игнорирует всю мозаику. Руководство Международного общества преимплантационной генетической диагностики (PGDIS) ( Leigh et al. , 2022 г.)) придерживается мнения о приемлемости переноса мозаичных эмбрионов в клинике и низком риске рождения нездоровых детей. Учитывая это, вся мозаика считалась эуплоидной при расчете диагностической конкордантности.
Получение высококачественных продуктов амплификации является необходимым условием для получения интерпретируемых результатов niPGT-A. Бесклеточная ДНК из отработанной культуральной среды постоянно генерируется и деградирует. Количество Бесклеточной ДНК, присутствующей в отработанной культуральной среде, зависит от генетического состава эмбриона, продолжительности культивирования и времени сбора образцов. Зарегистрированные показатели успеха амплификации отработанной культуральной среды варьируются от 62,7% до 95%, но исследования, в которых представлены эти данные, не были разработаны с учетом клинических условий ( Hanson et al. , 2021 ; Shitara et al. , 2021 ; Yeung et al. , 2019 ). . Чтобы обеспечить накопление Бесклеточной ДНК, сбор отработанной культуральной среды после продолжительного культивирования может нанести ущерб потенциалу развития эмбрионов, что клинически неприемлемо (Эрнандес-Ньето и др. , 2019 ; Кузнецов и др. , 2018 ). В этом исследовании условия культивирования эмбрионов были изменены путем уменьшения объема культуральной среды до 15 мкл. Метод PicoPLEX WGA также был модифицирован, чтобы сделать его пригодным для среды. Модифиция амплификации отработанной культуральной среды метод BCM-WGA прошел тщательный процесс тестирования перед использованием для амплификации отработанной культуральной среды, чтобы предотвратить возможную систематическую ошибку амплификации. При этом удалось успешно амплифицировать 88,6% образцов отработанной культуральной среды.
Загрязнение материнской ДНК отрицательно влияет на результаты niPGT-A. Бесклеточная ДНК из спермобластов и клеток кумулюса в отработанной культуральной среде может привести к загрязнению ( Ottolini et al. , 2015 ). Чтобы избежать этого, эмбрионы пациентов, перенесших интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов, тщательно промывали и заменяли культуральную среду на 4-й день. Однако, по крайней мере, в двух образцах было обнаружено сильное материнское загрязнение. Необходима дальнейшая оптимизация условий культивирования эмбрионов и методов тестирования, чтобы свести к минимуму материнское заражение при клиническом применении.
Следует упомянуть некоторые предостережения по изучению. Всего в этом исследовании было использовано 96 донорских эмбрионов (87 медленно замороженных эмбрионов 3-го дня плюс девять бластоцист 5-го дня). Из-за низкой скорости развития бластоцисты эмбрионов 3-го дня (26/87, 29,9%) в итоге было получено 35 бластоцист, что делает размер выборки в этом исследовании относительно небольшим. Кроме того, образцы остаточных бластоцист, использованные здесь, имели переменный процент загрязнения клеток внутренней клеточной массой. Поскольку клетки внутренней клеточной массы плотно упакованы в бластоцисту, отделить внутренней клеточной массы от остаточной бластоцисты было очень сложно. Образцы остаточной бластоцисты фактически представляли собой комбинации клеток трофэтодермы и внутренней клеточной массы. Хотя в предыдущих исследованиях сообщалось, что Бесклеточная ДНК в отработанной культуральной среде в основном происходит из трофэктодерме и внутриклеточной массе, niPGT-A отработанной культуральной среды теоретически должен иметь более высокую согласованность с PGT-A остаточной бластоцистой, чем PGT-A биопсии трофэктодермой.
В заключение, niPGT-A BCM обеспечивает точную и надежную оценку хромосомного статуса эмбриона, хотя производительность может не превосходить инвазивную PGT биопсии трофэктодермы в текущих обстоятельствах. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы изменить текущий процесс тестирования niPGT-A, чтобы свести к минимуму загрязнение материнской ДНК и повысить надежность.
*CNV Вариация числа копий (англ. Copy number variation, CNV) — вид генетического полиморфизма, к которому относят различия индивидуальных геномов по числу копий хромосомных сегментов размером от 1 тыс. до нескольких млн. пар оснований. CNV возникают в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Значительный полиморфизм по CNV у человека стал очевиден после окончания полного секвенирования нескольких геномов[1][2]. Крупные делеции или дупликации могут быть выявлены при микроскопическом анализе метафазных хромосом, однако подавляющая часть CNV выявляется при помощи сравнительной геномной гибридизации и при полногеномном SNP-генотипировании.
Результатом вариации может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена, и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена — белка или некодирующей РНК. (Википедия)