Когда в 1591 году Казы-Гирей подошёл к Москве, по приказу царя Фёдора Иоанновича, вокруг городских стен был совершен крестный ход с Донской иконой Богородицы, затем образ поместили в походную церковь в лагере русского войска. Ночью царю было видение, убедившее его в правильности действий. Противник подошёл к русскому лагерю, но решающей битвы так и не случилось. Войско Казы-Гирея более суток простояло у стен Москвы, а затем обратилось в бегство, оставив раненых, оружие и весь походный инвентарь.
По преданию, иконой Богородицы 1380 году преподобный Сергий Радонежский благословил святого князя Дмитрия Иоанновича на Куликовскую битву. Позже икону перенесли в Успенский собор в Коломне. В 1393 году вдова князя Евдокия Дмитриевна заказала список иконы знаменитому Феофану Греку. Икона находилась в храме Рождества Богородицы "на сенях", а потом была поставлена в Благовещенском соборе Кремля. С этого времени икона Богородицы получила название «Донская», как и святой благоверный князь Дмитрий. Каждый раз, в моменты тяжелых испытаний, москвичи молились перед Донским образом Богородицы, взывая о помощи.
Каменный собор в честь Донской иконы Пресвятой Богородицы был заложен одновременно с основанием обители, и назывался трапезным, в последствии, когда был построен Большой собор стал именоваться - Малым. Есть мнение, что строительством храма руководил известный зодчий Федор Конь, построивший стены Белого города.
Донской монастырь последним вошел в оборонительное полукольцо московских монастырей-крепостей, охранявших Москву от неприятеля, и находился на Калужской дороге, на тот момент, наименее защищенной.
В XVII веке в период Смуты поляки разграбили Донской монастырь. После этого обитель пришла в упадок и была приписана к Андроникову монастырю. Возрождение монастыря началось в 20-х годах XVII века благодаря усилиям царей Михаила Фёдоровича и Алексея Михайловича. Монастырь стал «богомольем царей», куда из Москвы совершались крестные ходы с участием царственных особ.
С 1684 года началось масштабное каменное строительство. Был построен Новый собор в честь Донской иконы Богородицы, позже получивший название Большого. В 1686-1711 годах были возведены монастырские стены с башнями, напоминающие стены Новодевичьего монастыря.
В 1705 году по распоряжению Петра I настоятелем Донского монастыря был назначен выдающийся иерарх Имеритинской Церкви, архимандрит Лаврентий (Габашвили). С этого момента Донской монастырь стал центром российско-грузинского взаимодействия в области дипломатии и культуры. В стенах Донского монастыря обрели вечный покой около 150 представителей грузинских царских и княжеских родов, породнившихся с представителями знатных российских семей.
В 1745 году императрица Елизавета Петровна дала монастырю ставропигиальный статус. В 1747 году сюда хотели перенести Славяно-греко-латинскую академию из Заиконоспасского монастыря. Но этого так и не произошло. В 1771 году, после эпидемии чумы, на монастырском кладбище стали хоронить людей. Здесь нашли свой последний приют представители знатных дворянских семей. К концу XVIII века Донской монастырь становится духовно-просветительским центром Москвы.
В 1812 году, когда армия Наполеона заняла Москву, Донской монастырь был разграблен и разорен. Однако все его здания, включая главный храм, уцелели после пожара. Вскоре после ухода захватчиков монастырь был восстановлен.
В течение всего XIX столетия продолжалось развитие архитектурного комплекса монастыря. В 1834 году здесь было основано духовное училище, где готовили учеников для поступления в семинарию. Сироты и дети из бедных семей обучались в монастыре бесплатно.
В Донском монастыре провел большую часть своего заточения Патриарх Московский и всея Руси, святитель Тихон (Белавин), который подвергся гонениям со стороны советской власти после революции 1917 года. Почти до самой своей кончины, которая наступила 7 апреля 1925 года, Патриарх находился в Донском монастыре, изолированный от своей общины. Отпевание Патриарха Тихона происходило в Большом соборе Донского монастыря, в присутствии 60 архиереев, после чего его тело было погребено в южной части Малого собора.
В 1926 году обитель была закрыта, но до конца 1920-х годов в ней еще оставались некоторые монахи, которым в силу возраста некуда было идти. В 1929 году все здания перешли в собственность государства, богослужения прекратились, монахов разогнали и репрессировали. Постройки монастыря были переданы антирелигиозному музею, интернату, фабрике и молочной ферме. В 1935 году в Донском монастыре открылся музей русской архитектуры, основанный Академией архитектуры СССР. Сюда были перевезены части памятников московского зодчества, подготовленные к уничтожению, включая горельефы храма Христа Спасителя, фрагменты оформления Успенской церкви на Покровке, наличники Сухаревской башни и малые архитектурные формы с московских кладбищ.
В 1936 году в Донской монастырь были перевезены бронзовые фрагменты оформления Триумфальной арки Брестского (Белорусского) вокзала. В 1967 году арка была восстановлена на Кутузовском проспекте, и большинство архитектурных элементов было возвращено на своё место. Сегодня на восточной стене монастыря можно увидеть два бронзовых горельефа, которые ранее украшали Триумфальную арку. В церкви Донского монастыря Архангела Михаила, которая служила усыпальницей князей Голицыных, был создан музей мемориальной скульптуры.
В 1948 году Московской патриархии вернули Малый собор Донского монастыря со статусом приходского храма Ризоположения на Донской улице. В 1982 году возникла дискуссия о передаче Донского монастыря Московской патриархии, но дальше разговоров дело не пошло. Московской патриархии монастырь был возвращён только в 1990 году, в год празднования 400-летия основания монастыря. Первым настоятелем монастыря был назначен насельник Троице-Сергиевой лавры архимандрит Агафадор (Маркевич).
Сейчас в монастыре активно проводятся работы по восстановлению и реставрации. На месте бывших монастырских садов были построены три небольших храма. В настоящее время здесь располагается Синодальный отдел по взаимодействию с казачеством, работают реставрационная мастерская, молодёжный клуб «Донской», научно-учебный центр лицевого шитья, Воскресная школа для детей и Богословские курсы для преподавателей Основ Православной культуры.