Сегодня мы с вами поговорим о биотехнологии, а именно об использовании биологических процессов в производстве необходимых для человека веществ. Здесь важны знания в области микробиологии, биохимии и технологии. Есть даже отдельная отрасль – биоинженерия, которая занимается созданием оборудования для биотехнологической промышленности.
Данная наука постоянно развивается. И то, чего ученые достигли на сегодняшний день, не было возможно в прошлом веке. Мы затронем только некоторые темы из этой области. Разберем темы, связанные со сдачей экзамена ЕГЭ в этой области. Нужно хорошо представлять последовательность процессов, происходящих при получении тех или иных веществ или культур клеток и тканей. Попробуем разобраться в этом вопросе вместе.
Наиболее важными и перспективными направлениями биотехнологии являются микробный синтез, генная и клеточная инженерия.
Генная инженерия
В генной инженерии используется целый ряд ферментов, наиболее важными являются:
1. Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы)
2. Ревертаза
3. ДНК-полимераза
4. ДНК-лигаза
5. Терминальная трансфераза
6. Нуклеаза
Основные этапы экспериментов генной инженерии.
1. Получение генов (ДНК материала), содержащих информацию о синтезе определенной молекулы полипептида.
ДНК материала получают в основном двумя путями: рестрикцией и синтезом. Рестрикция – разрезание геномной ДНК ферментами- рестриктазами. Так как в молекулах эукариот кроме экзонов есть еще и интроны, то выделенные участки ДНК эукариот не могут экспрессироваться в клетках прокариот. Промоторы эукариот в клетках прокариот тоже не пригодны. Фрагменты ДНК прокариот в клетках эукариот экспрессируются без особого труда.
Синтез гена может быть двух типов:
- искусственный синтез по последовательности аминокислот в соответствующем полипептиде. Метод применим для получения небольших генов. Например, гена соматостатина.
- синтез на и-РНК. Из клеток изолируют и-РНК с помощью фермента ревертазы. На ней получают комплементарную ДНК (к-ДНК), затем на матрице к-ДНК с помощью ДНК-полимеразы достраивают вторую цепь ДНК. Так как при дозревании и-РНК происходит сплайсинг, в результате которого удаляются интроны, то полученные подобным образом гены, подключенные к промоторам прокариот, экспрессируются в прокариотических клетках.
2. Лигирование. Включение ДНК материала в вектор-переносчик (плазмиды).
3. Введение вектора в клетки хозяина
Гены, выделенные из генома другого организма или полученные синтетически, вводят в клетки другого организма с помощью специализированных молекул ДНК-векторов, к которым предъявляют следующие требования:
1) Они должны реплицироваться в клетках, и поэтому должны содержать ДНК-репликатор (ориджины репликации), то есть нуклеотиды начала репликации.
2) Должны содержать сайты рестрикции.
3) Чтобы ген экспрессировался, вектор должен содержать специфические для данной клетки промоторы и терминаторы транскрипции.
4) Должны содержаться сигналы, связанные с рибосомами и кодоны инициации и терминации трансляции. ДНК, реплицирующиеся в клетках автономно называют репликонами.
В генетической инженерии используют векторы от естественных репликонов: плазмид, бактериофагов, вирусов. Векторы делятся на векторы прокариот, эукариот, челночного типа (в генетически неродственных клетках).
Для получения рекомбинанта между вектором и клонируемой ДНК используют рестриктазу, которая расщепляет вектор на обрабатываемую и клонируемую ДНК. Молекулу вектора и клонируемой ДНК сшивают, то есть лигируют, ДНК-лигазой. Иногда для получения рекомбинантных молекул используют линкеры, синтетические сегменты ДНК, имеющие один или несколько сайтов узнавания рестриктазы.
Внесение чужеродной ДНК с помощью фага называют трансдукцией, но чаще используют трансформацию или трансфекцию. Трансформация - введение в клетку фрагментов нативной (природной) ДНК, трансфекция – введение голой фаговой ДНК. Частота трансформации очень мала, одна клетка на несколько тысяч или десятков тысяч клеток, кроме того не все клетки содержат клонируемый ген. Для облегчения отбора рекомбинантных молекул применяют селективные маркеры, которые имеются у векторов прокариот. Такой способ используют при отборе на устойчивость к антибиотикам или метаболитам.
4. Скрининг. Выделение из массы клеток тех, в которые вошел вектор с включенным в него геном.
Сконструированы векторы для прямого отбора трансформантов. Колонии образуют только те клетки, в которых имеются клонируемые гены, а остальные погибают. Клетки с встроенным геном можно отбирать и по продукту внесенного гена. Используются также методы иммунологического отбора.
5. Экспрессия гена, то есть синтез продукта по информации гена.
Экспрессию внесенных генов осуществляют самые сильные промоторы, к которым подключены экспрессируемые гены. Желательно, чтобы промотор был регулируемым. Экспрессия гена зависит и от структуры гена. Если промотор подключен к гену с последовательностями сходными с последовательностями той клетки, в которую ген внесен, то выход продукта выше.
Клеточная инженерия.
Моноклональные антитела.
Гибридомная техника, в ходе которой получают моноклональные антитела, состоит из этапов:
1. Получение опухолевых клеток
2. Получение лимфоцитов-продуцентов антител к заданным антигенам. Животных иммунизируют введением антигена, потом выделяют клетки селезенки, от них отделяют лимфоциты.
3. Слияние опухолевых клеток с лимфоцитами. Слияющие агенты: полиэтиленгликоль, изолейцин, вирус Сендай, электрический импульс
4. Скрининг (выделение гибридом)
5. Проверка способности продуцировать антитела
6. Клонирование проверенных гибридных клеток с контролем на стабильность иммунных свойств
7. Получение массовых культур гибридомных клеток.