Позвольте познакомить вас с мнением специалистов в области репродуктивной медицины Alessandro Bartolacci из Италии (Obstetrics and Gynaecology Unit, IRCCS San Raffaele, Scientific Institute, Milan, Italy) и David F. Albertini из США (Bedford Research Foundation, Bedford, MA, USA) по вопросу перспектив и проблем, связанных с использованиемг протоколов быстрого размораживания ооцитов.
Итак, они пишут: "Криоконсервация ооцитов стала краеугольным камнем вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), запустив, так сказать, радикально иной подход к лечению бесплодия. Его широкое использование привело к большим возможностям и более широкому применению для пациентов с различными потребностями в планировании семьи, в то же время в целом повышая безопасность и эффективность процедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Исторически были реализованы два основных метода криоконсервации: медленное замораживание и витрификация. Медленное замораживание постепенно снижает их температуру с течением времени. Напротив, витрификация использует сверхбыстрый процесс охлаждения, который предотвращает образование кристаллов льда, которые могут повредить клеточным структурам. Витрификация стала стандартом при сохранении ооцитов и криоконсервации эмбрионов, учитывая популяризируемое восприятие из доступной литературы, что она улучшает показатели выживаемости ооцитов (по сравнению с медленной заморозкой) и лучшее сохранение жизнеспособности эмбрионов, последнее достигается за счет устранения менее стойких эмбрионов, неспособных выдерживать воздействие криоконсервации и размораживания.
Критической биофизической проблемой во время криоконсервации ооцитов является образование внутриклеточных кристаллов льда, что приводит к мембранным и внутриклеточным повреждениям. В частности, Seki и Mazur подчеркнули значение скорости размораживания как ключевого фактора, определяющего выживаемость ооцитов. Более того, во время процесса размораживания необходимо особое внимание для предотвращения чрезмерной регидратации, которая сама по себе вызывает повреждение zona pellucida или клеточной мембраны, тем самым ставя под угрозу жизнеспособность ооцитов. Текущие протоколы размораживания были оптимизированы для решения этих проблем путем включения нескольких этапов для разбавления криопротекторов. Хотя процессы размораживания чрезвычайно быстры, общая процедура довольно длительна, а продолжительность воздействия обычно составляет от 10 до 15 минут. Сокращение времени, необходимого для этих процедур, повысило бы эффективность рабочего процесса ЭКО и уменьшило бы воздействие на ооцит неоптимальных температур (комнатная температура) и стресса, вызванного осмолярностью, а также ограничило бы потенциально вредное воздействие криопротекторов.
Применение процедур быстрого размораживания к ооцитам представляет собой более сложную задачу из-за уникальных биофизических и биохимических свойств этих высокоспециализированных типов клеток. Ооциты представляют собой отдельные клетки и по своей природе более чувствительны к тепловому стрессу, чем эмбрионы. Кроме того, ооциты млекопитающих, не являющихся людьми, не полностью отражают человеческую модель, учитывая их фундаментальные биофизические свойства, что затрудняет экстраполяцию результатов.
Важно отметить, что Liebermann и его коллеги оценили выживаемость ооцитов и возобновление мейоза в незрелых человеческих ооцитах, применяя как быструю витрификацию, так и процедуры размораживания. За последние два десятилетия центры ЭКО по всему миру перешли от медленной заморозки к витрификации.
Стандартные протоколы витрификации обычно включают длительность около 8-15 мин в уравновешивающем растворе (ES) и 1 мин в витрифицирующем растворе (VS), в то время как быстрая витрификация включает 30 с в ES и 30 с в VS. Это вызывает опасения относительно применимости недавно разработанных протоколов быстрого размораживания, 1 мин в растворе для разбавления (DS) сахарозы 0,5 М и 1 мин в промывочном растворе (WS), к ооцитам, которые были витрифицированы с использованием традиционных методов, поскольку в настоящее время нет уверенности в том, что эти новые протоколы будут эффективны для этих ооцитов. Примечательно, что на сегодняшний день лишь немногие исследования подтвердили полезность быстрого нагревания на уровне живорождения или неонатальных исходов как для ооцитов, так и для эмбрионов, что является абсолютным требованием для современных ВРТ.
Более того, хотя было продемонстрировано, что сопоставимый уровень выживаемости ооцитов после быстрого размораживания сокращает время рабочего процесса, это имеет решающее значение для тщательного анализа способности ооцитов к развитию. Криоконсервация и процессы размораживания существенно влияют на компетентность развития ооцита. В частности, криоконсервация, как известно, вызывает нарушения в морфологии веретена, что может критически повлиять на раннее развитие после оплодотворения. Эти нарушения, такие как изменения в структуре веретена во время метафазы II, могут привести к изменениям в выравнивании и сегрегации хромосом, потенциально ставя под угрозу потенциал развития ооцита и любых эмбрионов, полученных в результате таких манипуляций, учитывая неизбежное «наследование» факторов веретена в зиготе, стадия, которая, как теперь
известно, изобилует вариациями клеточного цикла. В нескольких исследованиях подчеркивается чувствительность веретена ооцита к различным стрессам во время криоконсервации, что подчеркивает необходимость осторожной оптимизации протоколов для минимизации таких повреждений, которые могут быть нанесены как во время краткосрочного восстановления функции мейотического веретена, так и в течение долгосрочного воздействия на уже подверженные ошибкам клеточные деления, связанные с ранними стадиями дробления. Недавно на ежегодной конференции ESHRE 2024 были представлены два интересных доклада, в которых оценивалось воздействие быстрой витрификации и размораживания на ооциты. Водном исследовании сообщалось, что протоколы быстрой витрификации и размораживания достигли аналогичных показателей эффективности со стандартными протоколами в протестированных доклинических моделях, а также значительно сократили время обработки. В другом отчете было показано, что сверхбыстрая витрификация и размораживание сохраняют жизнеспособность ооцитов и качество эмбрионов, что подтверждается их эуплоидией. Однако эти исследования имеют ограничения. Первое исследование, хотя и сравнивало стандартную витрификацию с быстрым размораживанием, не использовало дизайн исследования, основанную на сиблингах. Второе исследование, несмотря на использование дизайна сиблингов, анализировало быструю витрификацию и размораживание в ассоциации, что ограничивало объем его результатов и применимость к стандартным витрифицированным ооцитам.
В заключение, хотя недавние достижения в области методов быстрой витрификации и размораживания предлагают многообещающие улучшения в рабочих процессах ЭКО, особенно с человеческими бластоцистами, их применение к ооцитам представляет собой ряд технологических и биологических проблем, которые не следует упускать из виду. Чувствительность ооцитов, особенно в отношении целостности веретена и способности к развитию, требует осторожности и дальнейших исследований. Применимость протоколов быстрого размораживания к ооцитам, ранее витрифицированным стандартными методами, остается неопределенной. Фундаментальные и клинические исследования необходимы для оптимизации этих протоколов, чтобы гарантировать их безопасную и эффективную интеграцию в текущую практику ВРТ."