I. Введение: Персонализация Лечения Рака – Интегративный Подход
1.1. Заголовок: Интегративная Платформа Диагностики и Терапии: Гистомика и Биоинженерия в Персонализированной Онкологии
1.2. Актуальность: Введение подчеркивает неуклонный рост заболеваемости раком и необходимость разработки новых подходов к диагностике и лечению.
· Выписка из научной работы: “Согласно данным GLOBOCAN, ежегодно регистрируется около 19 миллионов новых случаев рака, и к 2040 году ожидается увеличение заболеваемости более чем на 50% [1]. Неудовлетворительные результаты терапии многих видов рака, в особенности метастатических, обусловлены гетерогенностью опухолей, их адаптивной способностью к развитию резистентности к лечению и влиянием микроокружения.”
o [1] International Agency for Research on Cancer. (2020). GLOBOCAN 2020: Estimated cancer incidence and mortality worldwide. Available at: https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/900-world-fact-sheets.pdf
1.3. Проблема: Описание основных проблем, связанных с лечением онкологических заболеваний, и необходимость поиска новых подходов.
· Научная выписка: “Гетерогенность опухолей, как на генетическом, так и на клеточном уровне, характеризуется вариабельностью экспрессии генов, метаболических профилей, способностью к пролиферации и миграции, что определяет их разную чувствительность к цитотоксическим препаратам. В этой связи, необходимы подходы, учитывающие индивидуальные особенности опухоли пациента, а не только усредненные характеристики.”
o [2] Dagogo-Jack, I., & Shaw, A. T. (2018). Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology, 15(2), 81-94. doi: 10.1038/nrclinonc.2017.166
1.4. Цель и Задачи: Определение цели работы и основных задач исследования, с акцентом на создание валидированной платформы.
· Выписка: “Целью данной работы является разработка и валидация интегративной платформы, сочетающей методы гистомики, биоинженерии и геномного редактирования, для разработки персонализированных методов диагностики и лечения рака. Основными задачами являются: (1) разработка и оптимизация алгоритмов автоматизированного анализа гистологических изображений для количественной оценки параметров микроокружения опухоли; (2) создание биоинженерных трехмерных моделей опухолей in vitro, которые адекватно воспроизводят структуру и функцию нативных опухолей; (3) оценка эффективности действия лекарственных препаратов на трехмерных моделях опухолей с использованием валидированных методов; (4) разработка подходов к редактированию генома раковых клеток для повышения их чувствительности к терапии и создания CAR-T-клеток. “
II. Гистомика: Анализ Микроокружения Опухоли
2.1. Гистологические Методы: Описание методов, используемых для получения гистологических изображений (окрашивание гематоксилином и эозином, иммуногистохимия), с указанием используемых реагентов и условий.
· Описание: “Тканевые образцы, полученные при хирургической резекции опухолей, фиксировались в 10% нейтральном забуференном формалине (рН 7.4) в течение 24 часов и заливались в парафин. Срезы толщиной 4 мкм получали на ротационном микротоме и окрашивались гематоксилином и эозином (гематоксилин Майера, эозин Y, реагенты Merck) по стандартной методике [3]. Для иммуногистохимического исследования использовались первичное антитела к Ki-67 (клон MIB-1, Dako, разведение 1:100), CD3 (клон SP7, Abcam, разведение 1:200), CD68 (клон PG-M1, Dako, разведение 1:100) и PD-L1 (клон SP142, Spring Bioscience, разведение 1:50) с последующей визуализацией с использованием системы детекции EnVision Flex (Dako) и хромогена DAB.”
o [3] Kiernan, J. A. (2015). Histological and histochemical methods: theory and practice. Scion Publishing Ltd.
2.2. Цифровая Гистология: Определение процесса получения и обработки цифровых гистологических изображений, с указанием параметров сканирования.
· Описание: “Слайды сканировались с использованием цифрового сканера NanoZoomer 2.0-HT (Hamamatsu) в режиме 40x (числовая апертура 0.75) с разрешением 0.25 мкм/пиксель, что позволяло сохранить все детали микроструктуры тканей. Полученные изображения в формате TIFF анализировались с использованием программного обеспечения QuPath [4].”
o [4] Bankhead, P., Loughrey, A., Fernández, J. A. M., Dombrowski, Y., McArt, D. G., Dunne, P. D., … & Salto-Tellez, M. (2017). QuPath: Open source software for digital pathology. Scientific reports, 7(1), 1-7. doi: 10.1038/s41598-017-17188-5
2.3. Алгоритмы Гистомического Анализа: Описаны методы машинного обучения, используемые для количественного анализа гистологических изображений, с детальным описанием их параметров.
· Описание: “Для сегментации клеток и определения их морфологических параметров использовались алгоритмы глубокого обучения на основе сверточных нейронных сетей (CNN), обученные на наборе размеченных изображений (более 10000 клеток) [5]. Для классификации типов клеток (опухолевые, лимфоциты, макрофаги) применялся метод k-ближайших соседей (k-NN) с использованием 5 ближайших соседей и Евклидовой метрики. Количественные параметры микроокружения опухоли (плотность клеток, отношение ядерно-цитоплазматическое отношение, плотность сосудов, инфильтрация иммунными клетками) определялись с помощью специально разработанных программных модулей на основе библиотеки OpenCV. Вычислялся индекс стромальной активности (ISA), отражающий соотношение площади стромы и паренхимы с использованием пороговой бинаризации.”
o [5] LeCun, Y., Bengio, Y., & Hinton, G. (2015). Deep learning. Nature, 521(7553), 436-444. doi: 10.1038/nature14539
· Формула ISA:
· ISA = (Площадь стромы) / (Площадь паренхимы)
где площадь стромы и паренхимы определялись с использованием автоматической пороговой сегментации, с использованием метода Otsu.
III. Биоинженерия Трехмерных Моделей Опухолей
3.1. Матрицы для Трехмерных Моделей: Описан выбор и характеристики биоматериалов для создания скаффолдов, с детальным описанием их состава и структуры.
· Описание: “Для создания трехмерных моделей опухолей использовался биосовместимый, биоразлагаемый полимерный гидрогель на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) (молекулярная масса 10000 г/моль) с добавлением 100 мкг/мл фибронектина и 50 мкг/мл ламинина для улучшения клеточной адгезии [6]. Для повышения пористости гидрогеля использовалась технология лиофилизации с последующей обработкой ультразвуком. Пористость гидрогеля, определялась с помощью СЭМ, составляла 100-200 мкм, что было подтверждено с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), что обеспечивало диффузию питательных веществ и газообмен. Модуль упругости гидрогеля составлял 100-200 Па, что соответствует механическим свойствам нативной опухолевой ткани.”
· [6] Lutolf, M. P., & Hubbell, J. A. (2005). Synthesis and physicochemical characterization of end-linked poly(ethylene glycol)-based hydrogels formed by Michael-type addition. Biomacromolecules, 6(6), 3253-3259. doi: 10.1021/bm0503749
3.2. Клетки для Трехмерных Моделей: Описан процесс получения и культивирования клеток опухоли in vitro, с детальным описанием методов контроля качества клеточных культур.
· Описание: “Для создания трехмерных моделей использовались клетки опухоли, полученные из биопсий пациентов с помощью ферментативной диссоциации. Клетки культивировались в специальных средах DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) с добавлением 10% фетальной сыворотки, 1% L-глутамина, 1% антибиотика/антимикотика и 10 нг/мл фактора роста эпидермиса (EGF). Жизнеспособность клеток в культуре контролировалась с помощью МТТ-теста и окрашивания трипановым синим каждые 24 часа. Культуры были проверены на отсутствие микоплазменной контаминации.”
3.3. Создание Трехмерных Моделей Опухолей: Описан процесс создания трехмерных моделей опухолей in vitro с использованием биопринтинга, с указанием параметров печати.
· Описание: “Клеточные суспензии смешивались с раствором гидрогеля в соотношении 1:1 и наносились послойно на чашки Петри с использованием биопринтера 3DDiscovery (Regenovo) в режиме печати с диаметром сопла 200 мкм. Скорость печати составляла 5 мм/сек, расстояние между слоями составляло 250 мкм. Для поддержания жизнеспособности клеток в процессе культивирования, модели помещали в инкубатор с контролем температуры (37°C), влажности (95%) и содержания CO2 (5%) [7].”
· [7] Lee, Y., Polio, B. J., Lee, J. J., & Dai, G. (2014). Bioprinting of collagen and alginate for osteochondral tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods, 20(2), 187-197. doi: 10.1089/ten.tec.2013.0194
IV. Тестирование Лекарственных Препаратов и Редактирование Генома
4.1. Тестирование Лекарственных Препаратов: Описаны методы исследования действия препаратов на трехмерных моделях опухоли, с указанием используемых концентраций и методов оценки.
· Описание: “Действие лекарственных препаратов (химиотерапевтический препарат доксорубицин, таргетный препарат ингибитор EGFR гефитиниб, иммунотерапевтический препарат анти-PD-L1 антитело атезолизумаб) изучалось путем инкубирования трехмерных моделей опухолей с различными концентрациями препаратов (доксорубицин: 0.1, 1, 10 мкМ; гефитиниб: 0.01, 0.1, 1 мкМ; атезолизумаб: 1, 10, 100 мкг/мл) в течение 24-72 часов. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью МТТ-теста [8], а эффективность препаратов определялась путем измерения изменения размера опухолевого кластера с использованием программного обеспечения ImageJ.”
o [8] Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, 65(1-2), 55-63. doi: 10.1016/0022-1759(83)90303-4
4.2. Редактирование Генома: Описаны методы редактирования генома с использованием CRISPR-Cas9, с детальным описанием используемых конструкций и способов доставки.
· Описание: “Для редактирования генома раковых клеток применялась система CRISPR-Cas9 [9]. Для доставки CRISPR-Cas9 в клетки использовался лентивирусный вектор pLVX-Cas9-sgRNA, который содержал нуклеазу Cas9 и гидовую РНК (sgRNA) для мишеней в генах TP53 и EGFR. Эффективность редактирования генома оценивалась с помощью метода ПЦР и секвенирования с использованием праймеров, специфичных для мишеней в генах TP53 и EGFR. При этом, измерялась частота делеций, инсерций и замен в целевых областях генома с помощью программного обеспечения CRISPResso.”
o [9] Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821. doi: 10.1126/science.1225829
4.3. Клеточная Терапия: Описаны методы создания CAR-T-клеток (Химерный Антигенный Рецептор) и их тестирования in vitro, с акцентом на специфичность рецептора и протокол культивирования.
· Описание: “Для создания CAR-T-клеток использовались лимфоциты пациентов, выделенные из периферической крови. Т-лимфоциты модифицировались для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), нацеленного на специфический антиген EGFRvIII, экспрессирующийся на поверхности некоторых раковых клеток. CAR-T-клетки культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, 1% L-глутамина, 1% антибиотика/антимикотика, 100 ед/мл интерлейкина-2 и 1 мкг/мл антитела к CD3/CD28. Эффективность CAR-T-клеток оценивалась по их цитолитической активности в отношении клеток опухоли с помощью метода хромового высвобождения, с использованием радиоактивного хрома-51 [10].”
o [10] Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., & Chapuis, B. (1968). Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14(2), 181-196.
· Формула цитотоксичности: Цитотоксичность (%) = (1 - (Количество жизнеспособных клеток после обработки) / (Количество жизнеспособных клеток в контроле)) * 100
V. Результаты и Обсуждение
5.1. Гистомический Анализ: Описаны результаты анализа гистологических изображений с помощью разработанных алгоритмов, например, выявление новых корреляций между строением опухоли и прогнозом заболевания, с указанием статистической значимости.
· Выписка: “Гистомический анализ показал, что опухоли с высоким ISA (индекс стромальной активности) характеризуются статистически значимо большей инфильтрацией иммунными клетками (CD3+, CD68+) (p<0.001, t-критерий Стьюдента), и более благоприятным прогнозом заболевания (p<0.01, тест Манна-Уитни). Разработанные алгоритмы позволили выявлять ранее неизвестные морфологические характеристики, ассоциированные с резистентностью к химиотерапии, такие как форма ядра (коэффициент эксцентричности), и неоднородность распределения хроматина (энтропия). В контрольную группу входили образцы опухолей без иммунной инфильтрации. "
· Формула t-критерия Стьюдента:
· t = (X̄1 - X̄2) / √(s1²/n1 + s2²/n2)
где X̄1 и X̄2 – средние значения в двух выборках, s1 и s2 – стандартные отклонения, n1 и n2 – размеры выборок, р — вероятность ошибки первого рода
o Формула теста Манна-Уитни (представлена ранее, при необходимости ее можно привести повторно, в зависимости от требований к оформлению статьи)
5.2. Трехмерные Модели Опухолей: Представлены результаты сравнения свойств полученных моделей in vitro с нативными опухолями, с использованием статистических методов для доказательства сходства.
· Описание: “Трехмерные модели опухолей, созданные на основе ПЭГ-гидрогеля, показали высокую степень сходства с нативными опухолями по гистологическим характеристикам (наличие опухолевых и стромальных клеток, характер межклеточных взаимодействий), а также по метаболическому профилю (уровни экспрессии гликолитических ферментов, потребление глюкозы и производство лактата). Статистический анализ (тест Манна-Уитни) не выявил значительных отличий по уровню экспрессии гликолитических ферментов между трехмерными моделями и нативными тканями (p>0.05). Контрольной группой служили образцы нативной опухолевой ткани.”
5.3. Эффективность Лекарств и Геномного Редактирования: Описаны результаты тестирования лекарств и редактирования генома на трехмерных моделях, с указанием механизма действия и статистической значимости.
· Описание: “Лекарственные препараты (доксорубицин и гефитиниб), которые были эффективны в трехмерных моделях опухолей, также показали высокую эффективность in vivo в экспериментах на мышах, несущих трансплантированные опухоли (p<0.01, ANOVA, тест множественного сравнения Тьюки). При этом, механизм действия препаратов в отношении опухолевых клеток был подтвержден на молекулярном уровне. Геномное редактирование (с помощью CRISPR-Cas9) позволило эффективно корректировать мутации в генах TP53 и EGFR, участвующих в канцерогенезе (частота делеций и инсерций составила более 70% по данным секвенирования), повышая чувствительность клеток к терапевтическим препаратам (p<0.001, ANOVA). Контрольной группой служили клетки, не подвергшиеся редактированию генома."
· Формула ANOVA (представлена ранее, при необходимости ее можно привести повторно, в зависимости от требований к оформлению статьи).
5.4. Обсуждение: Анализ полученных данных и их интерпретация, а также обсуждение перспектив, ограничений исследования и дальнейших исследований.
· Обсуждение: “Полученные результаты демонстрируют потенциал интегративной платформы для персонализированного лечения рака. Однако, необходимо отметить, что исследование ограничено малым количеством образцов опухолевой ткани. Также необходима разработка более эффективных методов доставки лекарств и генетических конструкций в клетки опухоли. Эффективность редактирования генома необходимо оценивать, учитывая возможность возникновения off-target мутаций. Кроме того, необходимо проводить исследования для изучения долгосрочных результатов применения разработанной платформы и валидировать результаты в клинических исследованиях.”
VI. Заключение и Перспективы
6.1. Заключение: Вывод по результатам работы, подчеркивающий значимость интегративного подхода и вклад работы в научное знание.
· Вывод: “Представленная работа демонстрирует, что интеграция гистомики, биоинженерии и технологий геномного редактирования открывает новые перспективы для разработки персонализированных методов диагностики и лечения рака. Разработанная платформа позволяет получать более точную диагностическую информацию, моделировать особенности каждой опухоли и ускорить процесс тестирования новых лекарственных препаратов. Полученные данные являются значимым вкладом в научное знание, поскольку предложенный интегративный подход, используя передовые методы, позволяет создавать новые мишени для терапевтического воздействия и повысить эффективность лечения.”
6.2. Перспективы: Направления дальнейших исследований и перспективы клинического внедрения разработанной платформы, с акцентом на валидацию, новые биоматериалы, технологии доставки генов и приложения.
· Перспективы:
o Клиническая валидация: “Дальнейшие исследования будут направлены на валидацию разработанной платформы в клинических условиях, включая проведение многоцентровых рандомизированных клинических исследований фазы I/II на пациентах с различными видами рака. Эти исследования будут нацелены на оценку безопасности и эффективности платформы, а также ее влияния на выживаемость и качество жизни пациентов. Для этого планируется разработка протокола, соответствующего требованиям GCP (Good Clinical Practice), и получение необходимых разрешений от этических комитетов. Одним из основных критериев оценки клинической валидации будет сравнение эффективности лечения, основанного на данных интегративной платформы, с результатами стандартной терапии.”
o Новые биоматериалы: “Необходимо также проведение исследований, направленных на разработку новых биоматериалов для 3D-моделей опухолей, обладающих более точно воспроизводимыми характеристиками, в том числе способностью имитировать микроокружение опухоли, а также механические свойства нативной ткани. В частности, будет исследовано применение полимеров на основе биоактивных белков, а также использование комбинаций природных и синтетических материалов, включая коллаген, фибронектин и наночастицы, для создания биоматериалов с улучшенными свойствами.”
o Технологии доставки генов: “Улучшение технологий доставки генов в опухолевые клетки является критически важным для повышения эффективности геномного редактирования и клеточной терапии. Исследования будут направлены на разработку новых вирусных и невирусных векторов, обладающих высокой тропностью к раковым клеткам, низкой иммуногенностью и способных доставлять генетический материал в цитоплазму или ядро с высокой точностью. Одним из перспективных направлений является использование наночастиц с поверхностными лигандами, направленными на определенные рецепторы на поверхности раковых клеток.”
· Дополнительная разработка программного обеспечения: “Для обеспечения более эффективного использования разработанной платформы необходима разработка удобного и интуитивно понятного программного обеспечения для анализа данных и принятия решений. Это программное обеспечение должно включать модули для обработки цифровых гистологических изображений, визуализации данных, анализа результатов тестирования лекарств и редактирования генома. Кроме того, планируется интеграция этого программного обеспечения с системами электронного здравоохранения для более удобного использования в клинической практике. “
Приложения
* "Для более детального описания конкретных методов, таких как протоколы микроскопии (включая конфокальную и электронную микроскопию, а также методы визуализации, такие как микроскопия с высоким разрешением и многофотонная микроскопия), подробные протоколы окрашивания (с указанием концентраций и времени инкубации), алгоритмы машинного обучения (включая архитектуру нейросетей, подробные параметры обучения, и методы валидации), статистические тесты (с указанием формул, методов проверки нормальности распределения и методов сравнения нескольких групп) и описание процедур редактирования генома (включая выбор гидовых РНК и анализ off-target эффектов) можно использовать приложения к статье. В приложениях также будет представлен полный список используемого оборудования и реагентов.*"
*"Также в приложениях могут быть включены дополнительные материалы, такие как изображения и графики, которые не являются критическими для понимания основных результатов, но могут быть полезными для более глубокого изучения предмета."*
Объяснение внесенных изменений:
· Клиническая валидация: Раздел о клинической валидации расширен за счет указания на многоцентровые рандомизированные клинические исследования, а также требований GCP и сравнения с результатами стандартной терапии, что делает этот раздел более убедительным и реалистичным.
· Новые биоматериалы: Детализированы исследования по поиску новых биоматериалов, включая конкретные примеры биоактивных белков и природных/синтетических комбинаций. Это показывает конкретные направления для будущих исследований.
· Технологии доставки генов: Раздел о технологиях доставки генов дополнен описанием перспективных подходов, таких как использование наночастиц и адресных лигандов, а также акцентом на тропность и безопасность, что делает этот раздел более целенаправленным и обоснованным.
· Дополнительная разработка ПО: Добавлено описание необходимости разработки программного обеспечения для использования платформы в клинической практике.