Введение
Криоконсервация яйцеклеток преобразила вспомогательные репродуктивные технологии, обеспечив большую гибкость и эффективность в лечении бесплодия. Переход от традиционного медленного замораживания к витрификации (быстрой заморозке) значительно улучшил показатели выживаемости яйцеклеток за счет предотвращения образования кристаллов льда, которые могут повредить клеточные структуры. Несмотря на эти достижения, быстрое нагревание витрифицированных яйцеклеток остается сложной задачей из-за их уникальной чувствительности к тепловому и осмотическому стрессу, который может нарушить целостность веретена деления и способность к развитию.
Подробнее о главном...
Криоконсервация яйцеклеток стала краеугольным камнем вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), поскольку это радикально иной подход к лечению бесплодия. Его применение привело к расширению возможностей у пациентов с различными потребностями в планировании семьи, а также в целом к повышению безопасности и эффективности процедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Исторически сложилось так,что были внедрены два основных метода криоконсервации:
- медленное замораживание - когда происходит постепенное снижение температуры.
- витрификация - сверхбыстрый процесс охлаждения, предотвращающий образование кристаллов льда.
Витрификация стала стандартом криоконсервации яйцеклеток и эмбрионов, учитывая, что она улучшает состояние яйцеклеток , повышает выживаемость (по сравнению с медленным замораживанием) и лучше сохраняет жизнеспособность эмбрионов, причем последнее достигается за счет исключения менее жизнеспособных эмбрионов, неспособных противостоять воздействию криоконсервации и нагревания или оттаивания.
Влияние скорости оттаивания
Современные исследователи подчеркивают важность скорости потепления как ключевого фактора, определяющего выживаемость яйцеклеток после оттаивания. Кроме того, в процессе согревания необходимо уделять пристальное внимание предотвращению чрезмерной регидратации, которая сама по себе вызывает повреждение прозрачной оболочки или клеточной мембраны, тем самым снижая жизнеспособность яйцеклеток.
Несмотря на то, что процесс разогрева происходит чрезвычайно быстро, общая процедура довольно длительная, и обычно составляет от 10 до 15 минут. Сокращение времени повысило бы эффективность рабочего процесса, снизило бы воздействие на яйцеклетку неоптимальных температур (комнатной температуры), а также ограничило бы потенциально вредное воздействие криопротекторов.
В недавних публикациях были продемонстрированы первые обнадеживающие результаты при быстрой витрификации и нагревании ооцитов человека. Тем не менее, необходимо больше исследований для подтверждения этих результатов.
Методика заморозки и разморозки ооцитов
Стандартные протоколы "медленной" заморозки обычно включают в себя выдержку клетки от 8 до 15 минут в равновесном растворе (equilibration solution - ES) и 1 минуту в растворе для витрификации (vitrification solution - VS), в то время как протокол витрификации занимает по 30 секунд в каждом растворе.
Это вызывает опасения по поводу применимости недавно разработанных протоколов быстрого прогрева: 1 минута в растворе для дилюции (dilution solution - DS) 0,5М сахарозы (0,5М WS) и 1 минута в растворе для промывки (washing solution - WS), к ооцитам, которые были витрифицированы с использованием традиционных методов, и в настоящее время нет уверенности в том, что эти новые протоколы будут эффективны для таких ооцитов.
Примечательно, что на сегодняшний день лишь немногие исследования подтвердили преимущества быстрого оттаивания на уровне живорождения или неонатальных исходов как для яйцеклеток, так и для эмбрионов, что является абсолютным требованием для ВРТ. На сегодняшний день, даже если специалисты ВРТ примут эти новые протоколы быстрой витрификации и разогрева, остается серьезная проблема: миллионы яйцеклеток уже были витрифицированы стандартными методами с использованием различных наборов реагентов. В отношении этих яйцеклеток в настоящее время имеется мало научных данных, подтверждающих эффективность быстрого оттаивания, что подчеркивает необходимость дальнейших исследований, чтобы определить, получат ли протоколы быстрого размораживания более широкое применение.
Проблемы и решение
Процессы криоконсервации и разогрева/оттаивания существенно влияют на развитие яйцеклеток. Известно, что криоконсервация вызывает нарушения морфологии веретена деления, что может существенно повлиять на раннее развитие после оплодотворения. Изменения в структуре веретена во время метафазы II, могут привести к нарушениям в выравнивании и расхождении сестринских хромосом, а также ставят под угрозу потенциал развития как яйцеклетки, так и эмбрионов, полученных в результате таких манипуляций, учитывая неизбежное “наследование” веретенообразных факторов в зиготе. Некоторые исследования подчеркивают чувствительность веретена яйцеклетки к различным нагрузкам во время криоконсервации, подчеркивая необходимость тщательной оптимизации протоколов для минимизации повреждений, которые могут быть нанесены как во время кратковременного восстановления функции веретена, так и при более длительном воздействии на клеточные деления.
Наконец, важно уточнить, что термин "быстрое оттаивание" конкретно относится к сокращенному протоколу разбавления, разработанному для сокращения общего времени, затрачиваемого на фазы нагревания и разбавления, без влияния на скорость нагревания (время, необходимое для перехода температуры от жидкого азота к 37°C). Таким образом, "быстрое оттаивание" является вводящим в заблуждение термином, и "сокращенный протокол разбавления" был бы более точным. Однако скорость нагревания остается критической для минимизации рисков девитрификации и перекристаллизации, поскольку она снижает вероятность образования кристаллов льда внутри яйцеклетки. Этого можно достичь, повысив температуру согревающего раствора или уменьшив расстояние между криохранилищем яйцеклетки и согревающим раствором.
Выводы
Несмотря на недавние достижения в области методов быстрой витрификации и согревания, которые обещают улучшения в рабочих процессах применения ЭКО (особенно в отношении человеческих бластоцист), их применение к яйцеклеткам сопряжено с рядом технологических и биологических проблем, которые невозможно игнорировать. Чувствительность ооцитов, особенно в отношении целостности веретена и способности к развитию, требует осторожности и дальнейших исследований. Применимость протоколов быстрого разогрева к ооцитам, ранее замороженным стандартными методами, остается неопределенной. Фундаментальные и клинические исследования необходимы для оптимизации этих протоколов, обеспечения их безопасной и эффективной интеграции в современные методы ВРТ.