Принцип колоночной хроматографии
Колоночная хроматография — это аналитическая процедура или принцип разделения и очистки неорганических и органических соединений. Она может использоваться для разделения веществ на основе дифференциальной адсорбции соединений на адсорбенте, таком как активированный оксид алюминия или силикагель. Колоночная хроматография может использоваться в основном для очистки и разделения органических молекул, таких как белки, пигменты, аминокислоты, ферменты и крахмал. Это чрезвычайно трудоёмкий метод в любой лаборатории, но мы использовали его из-за низкой стоимости. Мы также использовали метод автоматической колоночной хроматографии для разделения и очистки соединений.
Выбор растворителя — самый важный этап в процедуре колоночной хроматографии, поскольку от выбора растворителя зависит степень адсорбции.
Процедура колоночной хроматографии
Процедура колоночной хроматографии используется для разделения смеси различных соединений с помощью следующих этапов:
- Адсорбент
- Выбор растворителя
- Упаковка колонны
- Размещение образца
- Разработка хроматограммы
Адсорбент
Активированный оксид алюминия (Al2O3) и силикагель (SiO2) являются наиболее часто используемыми и коммерчески доступными адсорбентами в методе колоночной хроматографии. Активированный оксид алюминия и древесный уголь являются сильными адсорбентами. Карбонат кальция, фосфат кальция, магнезия и гашёная известь являются примерами промежуточных адсорбентов.
Органические соединения, такие как сахароза, крахмал и инсулин, действуют как слабые адсорбенты. Усвояемость органических соединений зависит от природы и количества полярных групп, присутствующих в конкретных соединениях.
Выбор растворителя для колоночной хроматографии
Адсорбция зависит от выбора растворителя в процессе колоночной хроматографии. Для помещения вещества в колонку используется относительно неполярный растворитель, но для получения хроматограммы используется полярный растворитель.
Полярность растворителя постепенно увеличивается по мере вымывания поглощённого вещества. Скорость вымывания контролируется изменением активности абсорбента и полярности растворителя. Это чисто эмпирический метод.
Если соединения вымываются быстро, разделение получается некачественным. Для медленного вымывания мы использовали менее агрессивный абсорбент и слабополярный растворитель. Поэтому для слабоабсорбируемых соединений мы выбираем неполярные растворители, а для сильноабсорбируемых — полярные.
Полярность и выбор растворителя являются наиболее важными этапами в процедуре колоночной хроматографии. Порядок полярности обычно используемых растворителей следующий:
Петролейный эфир < четыреххлористый углерод < циклогексан < сероуглерод < эфир < ацетон < бензол < этилацетат < хлороформ < этанол < метанол < вода < пиридин < уксусная кислота.
Упаковка для колоночной хроматографии
Наполнение колонки в процессе хроматографии очень важно, так как позволяет избежать пузырьков воздуха и ошибок при разделении. Трубка колонки тщательно очищается и высушивается.
После использования растворителя его нельзя оставлять высыхать до завершения эксперимента. Колонки для хроматографии готовят методом сухой или влажной набивки.
Сухая упаковка при колоночной хроматографии
Мы использовали стеклянную трубку с пробкой в сухой упаковке. В верхнюю часть суженной части стеклянной трубки с помощью стеклянного стержня помещаем немного стеклянной ваты или ваты из хлопка. Стекло пропускает растворитель, но удерживает абсорбент в колонке, которая располагается вертикально.
В небольшую часть трубки для установки абсорбента добавляется взвешенное количество абсорбента. Перед использованием колонку промывают элюирующим растворителем. Для защиты поверхности стеклянной трубки кладётся диск из фильтровальной бумаги.
Мокрая упаковка при колоночной хроматографии
- При влажной набивке в колоночной хроматографии стеклянную трубку зажимают вертикально, удерживая её за суженный конец.
- Головка пробирки заполнена элюирующим растворителем.
- Подвижная суспензия абсорбента, приготовленная из элюирующего растворителя.
- Пробка колонки открывается для оседания абсорбента.
- Процесс повторяется до тех пор, пока не будет добавлена вся суспензия.
- Верхняя часть поверхности защищена, так как на неё кладут диск из фильтровальной бумаги.
Размещение образца
Образец, помещённый в колонку, представляет собой либо раствор в растворителе, либо жидкую смесь образца. Если твёрдый образец нерастворим в неполярном растворителе, мы используем полярный растворитель.
Его наливают в небольшое количество адсорбента и помещают в фарфоровую чашку для приготовления густой суспензии. Растворитель полностью выпаривают, помешивая стеклянной палочкой, когда суспензия приобретает пастообразную форму.
Хроматограмма
Раствор смеси образцов в подходящем растворителе медленно пропускают через колонку. Когда отдельные компоненты избирательно поглощаются, отображается хроматограмма.
В процессе колоночной хроматографии это окрашенная или бесцветная полоса или зоны. Таким образом, отдельные окрашенные полосы или зоны разделяются с помощью органических растворителей и собираются в коническую колбу объёмом 25 или 50 мл.
Если полосы на хроматограмме бесцветные, вместо стеклянной колонки используется кварцевая. Она помещается в свет ртутной лампы для обнаружения полосы с помощью флуоресценции. Бесцветные соединения также могут быть обнаружены с помощью реагентов, которые окрашиваются в цвет компонентов смеси образцов.
Разделение методом колоночной хроматографии
Процедура колоночной хроматографии широко используется для разделения,
- Нафталин из фенола
- Антрацен из пикрата антрацена
- Метиловый оранжевый из метилового синего
- Пигменты листьев (хлорофилл из каротиноидов)
Разделение органических соединений
- Колонку из оксида алюминия готовят методом влажной набивки с использованием гексана в качестве растворителя для отделения нафталина от фенола с помощью хроматографической колонки. Фенол хорошо адсорбируется на оксиде алюминия за счёт межмолекулярных водородных связей и хуже растворяется в неполярном гексане.
- С другой стороны, нафталин слабо поглощается оксидом алюминия из-за большей растворимости в гексане. Поэтому эти смеси можно легко разделить с помощью хроматографических колонок.
Мы также использовали принцип колоночной хроматографии для разделения органических соединений, таких как антрацен и антрацен-пикрилгидрат, а также метиловый оранжевый и метиловый синий.
Пикрат антрацена сильно поглощается колонкой из оксида алюминия, но антрацен поглощается слабо. Аналогично, метиловый оранжевый будет сильно поглощаться из-за наличия группы -SO3H, но метиленовый синий будет поглощаться слабо.
Разделение листовых пигментов
Колонку из оксида алюминия готовят методом влажной набивки с использованием растворителя лигроина для разделения пигментов листьев методом колоночной хроматографии.
Пигменты листьев содержат в основном хлорофиллы и каротиноиды. Каротиноиды — это углеводороды, содержащие изопреновые группы или их окси- или гидроксипроизводные. Хлорофилл бывает двух типов: хлорофилл-а и хлорофилл-б.
- Каротиноиды — это неполярные соединения, которые слабо поглощаются оксидом алюминия. Поэтому они легко вымываются углеводородными растворителями.
- Хлорофиллы содержат несколько полярных участков на молекулу. Поэтому они хорошо поглощаются оксидом алюминия и легко вымываются полярным растворителем.
Колоночная хроматография для очистки белка
Колоночная хроматография — один из наиболее распространённых методов разделения и очистки белков. Как правило, белки представляют собой гибкие аминокислоты с длинной цепью. Они могут быть как гидрофобными, так и гидрофильными, в зависимости от относительного количества содержащихся в них аминокислот.
Для разделения и очистки белков колонка заполняется мелкими шариками, покрытыми ионообменной смолой. Она притягивает гидрофобные аминокислоты к шарикам смолы.
Для разделения или очистки многих белков друг от друга с помощью колоночной хроматографии можно использовать ряд растворителей с разной концентрацией.
Аффинная колоночная хроматография
Метод аффинной колоночной хроматографии основан на исключительной способности биологических веществ, таких как белки, специфически и обратимо связываться с другими веществами, называемыми аффинными лигандами. Он используется в основном для очистки и разделения биологических макромолекул.
Биологические макромолекулы можно легко высвободить из аффинных комплексов, растворив их или изменив концентрацию растворителя. Такая диссоциация также возможна при изменении уровня pH, температуры и концентрации ионов.
Выделение, очистка и разделение белка, растяжение, антибиотик и фермент производятся с помощью аффинной колоночной хроматографии.