Репликация ДНК – это молекулярный процесс точного копирования молекул ДНК (ее нуклеотидной последовательности), на матрице другой ДНК. При чём синтезируемая последовательность полностью комплементарна матричной.
Основные принципы репликации ДНК:
1. Полуконсервативность.
Две новые спирали ДНК содержат по одной из матричной цепи материнской ДНК.
Уотсон и Крик выдвинули гипотезу полу-консервативной репликации ДНК после публикации своей статьи о структуре ДНК в 1953 году. В 1957 году гипотеза была подтверждена Мэтью Мезельсоном и Франклином Сталем, которые провели эксперименты с E. coli, выращенными на среде с тяжелым изотопом азота N15. ДНК выделенной из этих клеток имела плотность на 1% выше, чем у обычной ДНК с N14 и могла быть разделена центрифугированием в градиенте хлорида цезия. После переноса клеток на среду с N14 и их дальнейшего роста до удвоения численности, выделенная ДНК показала единую полосу, свидетельствующую о гибридной ДНК, содержащей одну цепь с N15 и одну с N14. Эти результаты опровергли теорию консервативной репликации. На следующем этапе эксперимента, после второго деления клеток на среде с N14, была выделена ДНК, которая разделилась на две полосы: одну легкую и другую гибридную, подтверждая полуконсервативную природу репликации.
2. Репликация начинается в точке начала реплика- ции и обычно идет в двух направлениях.
Исследования Джона Кэриса, проведенные с помощью авторадиографии, показали, что репликация ДНК в E. coli является высококоординированным процессом, где родительские цепи одновременно расплетаются и реплицируются. Кэрис использовал радиоактивный тимидин для маркировки ДНК, выявляя, что хромосома E. coli представляет собой кольцевую структуру длиной 1,7 мм и в ходе репликации образуется петля в результате формирования двух дочерних цепей, каждая из которых комплементарна родительской цепи.. Обе дочерние цепи реплицируются одновременно, и репликация бактериальных хромосом двунаправленная с активными репликативными вилками на обоих концах пети. Метод денатурирующего картирования, разработанный Россом Инманом, позволил установить реперные точки на ДНК и показать, что репликативные вилки возникают в определенных участках, названных точками начала репликации (ориджинами). У кольцевых молекул две вилки встречаются напротив этой точки. Специфические точки начала репликации были идентифицированы у бактерий и низших эукариот.
3. Синтез ДНК всегда происходит в направлении 5'-3', что означает, что нарастает цепь со стороны свободной ОН-группы на 3'-конце. Поскольку две цепи ДНК антипараллельны, матричная цепь считывается с 3'-конца к 5'-концу. Однако обе цепи должны синтезироваться одновременно, что вызывает проблему, так как одна из цепей должна синтезироваться в противоположном направлении относительно другой. В 1960-х годах Рейджи Оказаки с коллегами решила эту проблему, обнаружив, что одна из цепей синтезируется непрерывно, а другая — прерывисто, образуя короткие отрезки, известные как фрагменты Оказаки. Лидирующая цепь синтезируется непрерывно в направлении движения репликативной вилки, тогда как отстающая цепь синтезируется прерывисто в противоположном направлении. Длина фрагментов Оказаки варьируется от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов в зависимости от типа клеток.
Нуклеазы - ферменты расщипляющие ДНК
Нуклеазы делят на два больших класса:
1. Экзонуклеазы: расщепляют нуклеиновые кислоты с одного конца молекулы. Работают в направлениях 5’→3’ или 3’→5’, удаляя нуклеотиды с соответствующих концов цепей.
2. Эндонуклеазы: начинают расщепление изнутри молекулы, разрывая её на более мелкие фрагменты. Некоторые из них работают только с одноцепочечными ДНК.
ДНК-полимеразы - ферменты синтеза ДНК
В 1955 году Артур Корнберг с коллегами выделил и описал ДНК-полимеразу I из E. coli. Позже было обнаружено ещё четыре вида ДНК-полимераз у этого организма. Основные свойства для всех ДНК-полимераз:
1. Перенос фосфорильных групп от дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к 3'-гидроксильным группам нуклеотидов растущей цепи.
2. Образование фосфодиэфирной связи при освобождении неорганического пирофосфата.
3. Стабилизация удлиняющейся ДНК за счёт нековалентных взаимодействий оснований и их спаривания.
4. Высвобождение энергии при последующем гидролизе пирофосфата.
Условия для полимеризации ДНК:
1. Необходимость матрицы ДНК для реакции полимеризации.
2. Присоединение нуклеотидов к существующему участку цепи (праймеру), содержащему свободную 3'-гидроксильную группу.
Праймеры часто представляют собой олигонуклеотиды РНК. Полимеризация идёт быстрее, если полимераза остаётся связанной с матрицей после добавления каждого нуклеотида.
ТОЧНОСТЬ РЕПЛИКАЦИИ ДНК
Процесс репликации ДНК характеризуется высокой точностью. У E. coli вероятность ошибки составляет одну на 10 миллиардов добавленных нуклеотидов. Такая высокая точность обеспечивается несколькими факторами:
1. Специфичность активного центра полимераз к правильной паре нуклеотида, так как не комплементарные друг другу основания формируют геометрически не правильный нуклеотид, который не может встать в активный центр полимеразы.
2. Исправление ошибок: Дополнительные механизмы повышают точность репликации. Например, ДНК-полимеразы обладают 3'-5'-экзонуклеазной активностью, которая позволяет удалить не комплементарный нуклеотид. Данная активность называется - корректирующей.
*Дополнительная точность обеспечивается независимой ферментативной системой, которая за- меняет аномальные пары оснований, оставшиеся после репликации.
В ходе собранных данных, было установленно, что ДНК-полимерза I не является основной полимерзой для репликации полной хромосомы из-за:
1. Низкая скорость присоединения нуклеотидов: ДНК-полимераза I добавляет около 600 нуклеотидов в минуту, тогда как скорость движения репликативной – примерно в 100 раз быстрее.
2. Относительно низкая процессивность (процессивность - длинна цепи, которая способна синтезировать полимераза до того, как с денатурирует с матрицы)
3. В ходе репликации задействованы, те участки генома, которые кодируют отличные от ДНК-полимеразы I белки
4. В 1969 году Джон Кэрнс обнаружил штаммы бактерий с повреждённым геном ДНК-полимеразы I, которые всё равно оставались жизнеспособны.
После этих открытий были обнаружены другие ДНК-полимеразы:
- ДНК-полимераза II (Pol II) участвует в механизме репарации ДНК.
- ДНК-полимераза III (Pol III) является основным ферментом репликации у E. coli.
- ДНК-полимеразы IV и V, открытые в 1999 году, также играют роль в специфических механизмах репарации ДНК.
Таким образом, ДНК-полимераза I не является главным ферментом репликации, но участвует в репликации, рекомбинации и репарации.
Особенности ДНК-полимеразы I
ДНК-полимераза I имеет уникальную 5'-3' экзонуклеазную активность, которая позволяет ей удалять и заменять участки ДНК или РНК, связанные с матричной цепью. Этот механизм называется «ник-трансляцией». Эта активность отличается от стандартной корректирующей 3'-5' экзонуклеазной активности большинства других ДНК-полимераз.
*При обработке протеазами можно удалить 5'-3' экзонуклеазный домен, оставив большой фрагмент (Klenow fragment, M~r~ = 68 000), который сохраняет полимеразную и корректирующую активности.
CТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ III
ДНК-полимераза III гораздо сложнее по структуре, чем ДНК-полимераза I. Она состоит из субъединиц десяти различных типов:
- α-субъединица отвечает за полимеразную активность,
- ε-субъединица обеспечивает корректирующую активность.
Кор-фермент, образованный α- и ε-субъединицами, может синтезировать ДНК, но с ограниченной процессивностью. Для увеличения процессивности используются дополнительные субъединицы:
- Погрузчик зажима (γ-комплекс) связывает два кор-фермента вместе.
- Дополнительные субъединицы χ и ψ присоединяются к γ-комплексу.
Полный комплекс из 13 субъединиц девяти различных типов называется ДНК-полимеразой III. Процессивность этого фермента увеличивается за счёт образования В-зажимов, которые удерживают ДНК-полимеразу III на цепи ДНК, что увеличивает процессивность до 500 000 нуклеотидов и более.
В репликации ДНК участвует множество ферментов и белковых факторов. Для Escherichia coli (E. coli) необходимы не только ДНК-полимераза, но и более 20 различных белков, образующих ДНК-репликативную систему (реплисом). Чтобы обеспечить доступ к цепям ДНК, необходимо разделить две родительские цепи. Этот процесс осуществляется хеликазами, которые движутся вдоль ДНК, используя энергию АТР. Разделение создает топологическое напряжение, которое снимается топоизомеразами, а разделенные цепи стабилизируются ДНК-связывающими белками. Перед синтезом ДНК на матрице должны находиться праймеры — короткие сегменты РНК, синтезируемые праймазами. РНК-праймеры затем удаляются и заменяются на ДНК, что выполняет ДНК-полимераза 1. После этого остаются разрывы (ники), которые зашиваются ДНК-лигазами.
СТАДИИ РЕПЛИКАЦИИ ХРОМОСОМ У E.Coli
Репликация хромосомы Escherichia coli (E. coli) включает три ключевые стадии:
1. Инициация – начало процесса репликации.
2. Элонгация – удлинение новой цепи ДНК.
3. Терминация – завершение процесса репликации.
Инициация репликации. Точкой начала репликации у E. coli является участок oriC длиной 245 пар нуклеотидов. Основные элементы oriC включают:
- Пять повторяющихся участков размером по 9 пар нуклеотидов (R-сайты), где связывается ключевой инициаторный белок DnaA.
- А-Т-богатый участок, известный как элемент расплетения ДНК (DUE).
- Три дополнительных сайта связывания для белка DnaA (I-сайты).
- Сайты связывания для белков IHF и FIS, играющих роль в процессах рекомбинации.
В процессе инициации принимают участие минимум десять различных ферментов и белков, среди которых ключевыми являются DnaA, DnaB, DnaC, а также вспомогательные белки HU, IHF и FIS. Роль белка DnaA: Белок DnaA играет центральную роль в инициации репликации. Он принадлежит к семейству AAA+ ATPаз, которые способны гидролизовать АТР и изменять свою активность в зависимости от наличия связанной молекулы АТР или ADP. Активная форма DnaA связана с АТР. Восемь молекул DnaA формируют спиральный комплекс, который охватывает R- и I-сайты в oriC. DnaA обладает высоким сродством к R-сайтам независимо от состояния АТР/ADP, тогда как I-сайты связывают только АТР-связанную форму DnaA.
Формирование начального комплекса. Комплекс DnaA с ДНК вызывает локальное напряжение, приводящее к денатурации А-Т-богатого участка DUE. Дополнительные белки HU, IHF и FIS способствуют изгибу ДНК, облегчая её расплетение. Затем белок DnaC помогает загрузке DnaB на разошедшиеся нити ДНК в области DUE. Комплекс DnaC с DnaB формирует гексамер, который взаимодействует с DnaA. После гидролиза АТР, связанный с DnaC, освобождается, оставляя DnaB связанным с ДНК.
Начало работы хеликазы. Присоединение хеликазы DnaB к ДНК является ключевым моментом в инициации репликации. Хеликаза начинает раскручивание двойной спирали ДНК, двигаясь вдоль одной из нитей в направлении 5'-3'. Две молекулы DnaB, связанные с каждой из нитей ДНК, движутся в противоположных направлениях, формируя две репликативные вилки. Таким образом, инициация репликации завершается формированием активного репликативного комплекса, готового к началу стадии элонгации.
Завершение инициации и начало элонгации. После разделения нитей ДНК в области репликативной вилки они стабилизируются множеством молекул белка, связывающего одноцепочечную ДНК (SSB). Для снятия топологического напряжения, возникающего при раскручивании ДНК, используется фермент ДНК-гираза (топоизомераза II). Процесс инициации регулируется таким образом, чтобы репликация происходила только один раз за клеточный цикл. Когда ДНК-полимераза III и субъединица B связываются с ДНК, это свидетельствует о завершении фазы инициации. С субъединицей B связывается белок Hda, который взаимодействует с DnaA и стимулирует гидролиз связанного с ним АТР. Белок Hda относится к семейству AAA+ ATPаз, подобных DnaA. Гидролиз АТР приводит к разборке комплекса DnaA в точке начала репликации.
Метилирование ДНК и взаимодействие с мембраной. На процесс инициации влияют метилирование ДНК и ее взаимодействие с плазматической мембраной бактерии. В области oriC ДНК метилируется ферментом Dam-метилазой, которая добавляет метильную группу к аденину в последовательности GATC(позже это будет важно в репарации). Последовательность oriC содержит большое количество таких повторов (11 на 245 пар оснований), что значительно превышает среднее значение для всей хромосомы (один повтор на каждые 256 пар оснований). Сразу после репликации ДНК становится полуметилированной: родительские цепи метилированы, а новые цепи — нет. Полуметилированные последовательности oriC временно изолируются благодаря взаимодействию с плазматической мембраной и связыванию с белком SeqA. Со временем эта связь разрывается, SeqA диссоциирует, и Dam-метилаза полностью метилирует ДНК перед началом нового раунда репликации. Таким образом, процесс инициации строго контролируется различными механизмами, обеспечивая точное и своевременное начало репликации.
Элонгация
Фаза элонгации репликации ДНК включает два взаимосвязанных процесса: синтез лидирующей и отстающей цепей.
Раскрытие двойной спирали ДНК
1. Раскрутка ДНК: ДНК-хеликаза раскручивает двойную спираль ДНК, создавая репликативную вилку.
2. Снятие напряжения: Топологические изменения, возникающие при раскручивании, снимаются ферментами топоизомеразами.
3. Стабилизация одиночных цепей: Белок SSB (Single Strand Binding protein) стабилизирует каждую из одноцепочечных участков ДНК, саддясь на каждую из цепей.
Синтез лидирующей цепи. Праймаза (DnaG) синтезирует короткий РНК-праймер (10–60 нуклеотидов) в точке начала репликации. Этот праймер служит стартовой точкой для последующего добавления дезоксирибонуклеотидов. DnaG взаимодействует с хеликазой DnaB, причём направление синтеза праймера противоположно направлению движения хеликазы. Несмотря на то, что хеликаза движется вдоль будущей отстающей цепи, первый праймер используется для старта синтеза лидирующей цепи.
Непрерывный синтез: После инициации, ДНК-полимераза III (Pol III) добавляет дезоксирибонуклеотиды к растущей цепи. Синтез лидирующей цепи происходит непрерывно и согласованно со скоростью раскручивания ДНК.
Синтез отстающей цепи. Фрагментарный синтез: Отстающая цепь синтезируется дискретными фрагментами, называемыми фрагментами Оказаки. Каждый такой фрагмент инициируется новым РНК-праймером, который также синтезируется праймазой. ДНК-полимераза III связывается с каждым праймером и начинает добавлять дезоксирибонуклеотиды, образуя новый фрагмент ДНК. Координация синтеза обеих цепей обеспечивается благодаря тому, что оба процесса происходят под контролем одного димера ДНК-полимеразы III. Это достигается путём образования петли из отстающей цепи.
Синтез фрагментов Оказаки на отстающей цепи осуществляется благодаря функционированию ферментативного аппарата. DnaB-хеликаза и DnaG-примаза формируют функциональный блок, называемый праймосомой, входящей в состав репликативного комплекса. DnaB-хеликаза, расположенная перед ДНК-полимеразой I, раскручивает ДНК в репликативной вилке, двигаясь вдоль матрицы отстающей цепи в направлении 5'-3'. Время от времени ДНК-праймаза соединяется с DnaB-хеликазой и синтезирует короткий РНК-праймер. Погрузчик зажима ДНК-полимеразы II затем фиксирует на праймере новый скользящий β-зажим. Когда синтез фрагмента Оказаки завершается, репликация временно останавливается, кор-фермент ДНК-полимеразы I отделяется от одного зажима и присоединяется к новому, начиная синтез следующего фрагмента Оказаки. Весь этот процесс координации синтеза ДНК в репликативной вилке обеспечивается реплисосомой.
Реплисома обеспечивает быстрый синтез ДНК, добавляя около 1000 нуклеотидов в секунду к каждой цепи (лидирующей и отстающей). После завершения формирования одного фрагмента Оказаки его РНК-праймер удаляется и заменяется последовательностью ДНК с использованием ДНК-полимеразы I, а оставшаяся щель заполняется ДНК-лигазой. ДНК-лигаза катализирует формирование фосфодиэфирной связи между 3'-гидроксильной группой одной цепи ДНК и 5'-фосфатом другой цепи. Фосфат предварительно активируется аденилированием. ДНК-лигазы, полученные из вирусов и эукариотов, используют для активации АТР, тогда как бактериальные ДНК-лигазы применяют NAD+ в качестве источника энергии. ДНК-лигаза является важным ферментом в метаболизме ДНК и широко используется в экспериментах с рекомбинантными ДНК.
Терминация репликации кольцевой хромосомы E. coli происходит в точке терминации, содержащей последовательности Ter (от латинского "terminus" — конец), состоящие из 20 повторяющихся последовательностей. Эти последовательности служат местами связывания белка Tus, образуя комплексы Tus-Ter, которые могут остановить продвижение репликативной вилки только в одном направлении. В каждом цикле репликации функционирует лишь один такой комплекс, с которым сталкивается первая репликативная вилка. Хотя остановка обеих вилок возможна при их столкновении, Ter-последовательности предотвращают избыточную репликацию в случае задержки или остановки второй вилки. Когда одна вилка достигает функционального комплекса Tus-Ter, она останавливается, а вторая вилка останавливается при встрече с первой. Оставшиеся пары оснований ДНК между двумя белковыми комплексами реплицируются, формируя два топологически сцепленных (катенированных) кольца ДНК, называемых катенанами. Разделение этих катенанов выполняется топоизомеразой IV, после чего хромосомы распределяются по дочерним клеткам при делении. Аналогичный механизм терминации репликации характерен и для других кольцевых хромосом, включая ДНК некоторых вирусов, инфицирующих эукариоты.
РЕПЛИКАЦИЯ В ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ ПРОИСХОДИТ ПО ПОХОЖЕМУ МИХАНИЗМУ
Молекулы ДНК в эукариотических клетках значительно больше, чем в бактериях, и образуют сложные нуклеопротеиновые структуры, известные как хроматин. Общая схема репликации ДНК у эукариот похожа на бактериальную. Однако у эукариот процесс репликации строго регулируется и координируется в соответствии с фазами клеточного цикла. Участки начала репликации (точки инициации) у эукариот варьируются в зависимости от вида организма. Регулирование репликации у эукариот обеспечивается белками циклинами и циклин-зависимыми киназами (CDK), которые регулируют различные стадии клеточного цикла. Циклины быстро разрушаются в конце митоза, что способствует формированию пререпликативных комплексов (pre-RC) в точках инициации репликации. Образование этих комплексов необходимо для начала репликации и называется лицензированием. Инициация репликации у эукариот включает присоединение репликативной хеликазы МСМ (субъединицы МСМ2-7), которая работает совместно с комплексом распознавания точки инициации репликации (ORC). Этот процесс подобен бактериальному. ORC состоит из пяти ААА+ АТРазных доменов и выполняет функцию, аналогичную бактериальному комплексу OpaA. Для присоединения комплекса МСМ2-7 требуются дополнительные белки CDC6 и CDT1, причем дрожжевой белок CDC6 также является ААА+ АТРазой.
Для репликации в S-фазе синтезируются и активируются комплексы циклин-CDK (циклин Е-CDK2) и CDC7-DBF4. Они активируют репликацию путём связывания и фосфорилирования белков пререпликативных комплексов. Другие циклины и CDK препятствуют образованию новых pre-RC-комплексов после начала репликации. Например, CDK2 связывается с циклином A, подавляя активность CDK2 и предотвращая образование дополнительных pre-RC-комплексов. Скорость репликативной вилки у эукариот составляет около 50 нуклеотидов в секунду, что в 20 раз медленнее, чем у E. coli. Для ускорения процесса репликация хромосомы человека начинается одновременно в нескольких точках, расположенных на расстоянии от 30 до 300 тысяч пар нуклеотидов.
У эукариот существует несколько типов ДНК-полимераз, каждая из которых выполняет особые функции. В репликации ядерных хромосом участвуют ДНК-полимераза α и β. ДНК-полимераза α, не обладает 3-5'-экзонуклеазной активностью и служит для синтеза коротких праймеров и фрагментов Оказаки. Удлинение праймеров происходит с помощью ДНК-полимеразы δ, которая связывается с белком PCNA, формирующим кольцевой зажим и увеличивающим процессивность полимеразы. ДНК-полимераза δ обладает 3-5'-экзонуклеазной активностью и синтезирует как лидирующую, так и отстающую цепь. ДНК-полимераза ε заменяет полимеразу δ при репарации ДНК. так же она удаляет праймеры фрагментов Оказаки. В репликации также участвуют белки RPA, связывающие одноцепочечную ДНК, и RFC, выступающий в роли погрузчика зажима для PCNA. Важно отметить, что на концах хромосом синтезируются теломеры для терминации репликации.
Надо отметить, что синтез теломер теломеразой, один не из многих, процесс обратной транскрипции(подобный механизм встречается так же у ретро-вирусов).
Данная статья является конспектом по книге Д.Нельсона, М.Кокса "Основы Биохимии Ленинджера" том 3 Пути передачи информации. Глава о репликации ДНК.