При замораживании преимплантационных эмбрионов и гамет различных видов лабораторных животных могут возникать всевозможные трудности. Наиболее полно и надежно процедуры, связанные с криоконсервацией эмбрионов и гамет, а также последующим получением живых потомков отработаны на мышах. С некоторыми модификациями, эти протоколы позволяют криоконсервировать преимплантационные эмбрионы и других видов лабораторных грызунов, таких, как крысы.
При попытках создания криобанков других представителей животного царства, не относящихся к классу млекопитающих, возникают иногда более серьезные проблемы. Как уже говорилось выше, рыбки Danio rerio являются, в настоящее время, одним из самых популярных лабораторных объектов, востребованных для генетических и биомедицинских исследований. Между тем, эмбрионы или яйцеклетки рыб, в настоящее время, пока не удается криоконсервировать из-за их большого размера, высокого содержания липидов, плохой проницаемости мембран и высокой чувствительности к охлаждению. Подобная проблема, связанная с плохой проницаемостью мембран для криопротекторов характерна не только для эмбрионов рыб. В работе с эмбрионами плоских червей (Macrostomum lignano) было показано, что традиционные криопротекторы, такие как глицерин, этиленгликоль, метанол и ДМСО плохо проникают через мембраны эмбрионов и взрослых червей, что затрудняет проведение, как программного замораживания, так и витрификации.
Делаются попытки обойти проблему, замораживая фолликулы яичников Danio rerio и осуществляя дозревание этих фолликулов in vitro; получены первые обнадеживающие результаты, хотя и предварительные. Интересный и оригинальный подход к замораживанию эмбрионов Danio rerio был предложен группой американских исследователей. Они ввели в эмбрионы мРНК аквапорина-3, которая, в свою очередь, является водным каналом. При этом удалось существенно повысить проницаемость мембран эмбрионов этого вида рыб. Тем не менее, окончательной цели – успешной криоконсервации эмбрионов и яйцеклеток Danio rerio (и каких-либо других видов рыб) достичь, пока не удалось.
Трупный червь (Caenorhabditis elegans, Maupas, 1900) стал востребован для исследований в различных областях биологии и появилась потребность в разработке способа криоконсервации этого важного для исследователей организма. В конце концов, удалось успешно криоконсервировать взрослых особей, которые являются многоклеточными организмами, состоящими из сотен клеток и обладающими нервной системой. Это является большим достижением, поскольку, чем больше и чем сложнее объект, тем более проблематична его успешная криоконсервация.
Если сравнивать медленное замораживание и витрификацию, то каждый из этих подходов имеет свои сильные и слабые стороны. Одним из плюсов витрификации является то, что при данном способе не происходит образования кристаллического льда (ни внутри, ни вне клеток), а это в свою очередь устраняет основную причину повреждений в результате замораживания. В связи с этим обстоятельством, витрификация становится все более популярной, особенно в тех случаях, когда эмбрионы в силу тех или иных причин плохо переносят традиционное программное замораживание. Как отмечалось в предыдущих разделах данного обзора, к приоритетным лабораторным животным, на которые нацелена программа создания криобанков, кроме мышей и крыс, относятся свиньи, кошки и собаки. У свиней и у всех представителей отряда хищных, включая кошек и собак, в эмбрионах содержится большое число липидных гранул чувствительных к охлаждению. Для облегчения процедуры замораживания эмбрионов этих видов чаще всего применяют витрификацию, иногда в сочетании с другими специальными приемами, такими, как делипидизация.
Однако витрификация также имеет и свои негативные стороны. Так, например, практически все эффективные протоколы витрификации подразумевают открытое взаимодействие витрифицируемого образца и жидкого азота, при этом возможна контаминация образца через жидкий азот. Более существенным недостатком витрификации является то, что сохраняемые образцы требуют жесткого контроля температурного режима хранения и специального режима оттаивания. При колебании температуры в хранилище или недостаточно быстром оттаивании в образце может произойти летальная девитрификация. Это повышает требования к условиям криохранения биологического материала. Следует отметить, что мониторингу условий криогенного хранения биологического материала в криобанке и компьютерного учета базы данных уделяется большое внимание и некоторые отечественные криобанки уже оснащены такими системами.
В заключение хотелось отметить, что за те десятилетия, которые прошли с момента первого успешного замораживания эмбрионов мышей и организации первых криобанков удалось достигнуть огромного прогресса. Однако и в наши дни перед криобиологами и специалистами по созданию криобанка лабораторных животных встает немало проблем, особенно, если работать приходится не с мышами, а другими видами. Мультидисциплинарный подход, когда биологи объединяют усилия с физиками и представителями других наук позволяют более успешно решать эти проблемы, как в плане практических приложений, так и в плане фундаментальных криобиологических исследований.