Цель
Целью настоящего исследования является оценка влияния буферного агента рH на поверхность, прошедшую грубозернистую пескоструйную обработку и травление кислотой (SLA), с точки зрения ее смачиваемости, аффинности к остеобластам, а также адгезии к поверхности белков крови и тромбоцитов, и их активации.
Методы
В ходе исследования использовали титановые диски и имплантаты с обычной поверхностью SLA (SA), поверхностью SLA в водном растворе хлорида кальция (СA) и поверхностью SLA, покрытой буферным агентом рH (S01). Для оценки скорости смачивания измеряли число витков резьбы, смоченных кровью за определенный промежуток времени. Адсорбцию сывороточного альбумина проверяли с помощью анализа на бицинхониновую кислоту и за счет измерения интенсивности флуоресценции. В ходе исследования также оценивали активность остеобластов (включая адгезию, пролиферацию, дифференцировку, миграцию и минерализацию остеобластов), анализировали адгезию и активацию тромбоцитов.
Результаты
Результаты тестов на скорость смачивания и адсорбцию сывороточного альбумина свидетельствуют о значительно более высокой скорости смачивания поверхности S01 по сравнению с поверхностью SA (р=0,000 и р=0,000 соответственно). В тестах, оценивающих адгезию, пролиферацию, дифференцировку и минерализацию остеобластов, средние значение показателей были выше в группе S01 по сравнению с группами SA и СA. Поверхность S01 характеризовалась существенно более высокой скоростью миграции остеобластов, адгезии и активации тромбоцитов, чем поверхность SA (р=0,04, р=0,000 и р=0,000 соответственно).
Вывод
Поверхность S01 характеризуется более выраженной гидрофильность и аффинностью к белкам, клеткам и тромбоцитам по сравнению с поверхностью SA. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что покрытие имплантата буферным агентом рH способствует адгезии тромбоцитов, белков и клеток к его поверхности. Для оценки эффективности и безопасности поверхности S01 в сравнении с другими распространенными поверхностями требуется проведение клинических исследований.
Введение
Усовершенствование титановых имплантатов позволило ускорить их остеоинтеграцию, сократить сроки протезирования и увеличить показатель успеха имплантологического лечения. Усилия производителей были в первую очередь направлены на модифицирование поверхности имплантата -6 физическими и химическими методами для придания ей гидрофильности и увеличения показателя контакта имплантата с костью.5'7-9 По данным целого ряда исследований, грубозернистая пескоструйная обработка и травление кислотой позволяют получить поверхность (SLA) с микро- и макротопографией, способствующую достижению хороших клинических результатов.
Кроме того, были разработаны химические методы модифицирования поверхности SLA. Так, для получения поверхности SLAсtive (Straumann, Базель, Швейцария) поверхность SLA погружают в изотонический раствор хлорида натрия для предотвращения ее контаминации углеродом, содержащимся в атмосферном воздухе. По данным исследований, поверхность SLAсtive ускоряет формированию костной ткани на ранних этапах заживления. Компании 0sstem удалось создать химически активированную поверхность SLA, модифицированную кальцием (Osstem Imрlant Сo., Ltd., Пусан, Корея), за счет погружения имплантата в раствор хлорида кальция вместо хлорида натрия. Результаты доклинического исследования на кроликах показали, что модифицированная кальцием поверхность и поверхность SLAсtive характеризуются схожими показателями контакта с костью.
На свойства имплантата может влиять взаимодействие клеток крови с молекулами на поверхности имплантата. Разнообразные белки, включая факторы роста и дифференцировки, притягиваются к гидрофильным поверхностям. В ряде исследований in vitro оценивали влияние биохимических характеристик поверхности имплантата на жизнеспособность, пролиферацию, прикрепление и дифференцировку клеток: полученные результаты свидетель- ствуют о взаимосвязи между свойствами поверхности и клеточной активностью.
Формирование достаточного по размеру фибринового сгустка обеспечивает прямую и стабильную связь между поверхностью имплантата и прилегающей костной тканью, поэтому он играет важную роль в тромбогенном ответе и остеоинтеграции имплантата. 5 Наблюдение за сгустками фибрина на различных поверхностях выявило взаимосвязь между характеристиками поверхности и размером фибринового сгустка.
Формирование ложа имплантата приводит к травме костной ткани, схожей с переломом. Развивается гипоксия, внеклеточный рН снижается. В кислой среде стромальные клетки костного мозга характеризуются низкой активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) и низким синтезом коллагена, играющих важную роль в формировании костной ткани. 7 Так, было выявлено снижение активности ЩФ с пикового значения при рH 7'4 практически до нуля при рH менее 7.18. По данным других исследований, уровень кислотности влияет на активность ЩФ, синтез коллагена, а также гликолиз и синтез ДНК остеобластов. 9 Внеклеточный ацидоз влияет на вход в клетку ионов кальция, опосредованно снижая агрегацию тромбоцитов.
В ходе настоящего исследования оценивали эффективность химически активированной поверхности SLA, покрытой буферным раствором рH. Согласно результатам исследований, она характеризуется высокой аффинностью к белкам, клеткам и тромбоцитам, что в свою очередь способствует быстрому и стабильному свертыванию крови и тромбогенезу. Целью данного исследования было сравнение эффективности поверхности SLA, покрытой буферным раствором рH, обычной поверхности SLA и химически активированной поверхности SLA, модифицированной кальцием, в условиях in vitro. Сопоставляли ряд параметров, включая адгезию белков крови, аффинность к остеобластам, а также адгезию и активацию тромбоцитов.
Материалы и методы
Подготовка титановых дисков, имплантатов и реагентов
Компания Osstem Imрlant предоставила титановые диски и имплантаты с тремя типами поверхности для проведения настоящего исследования:
1) Обычной поверхностью SLA (SA, группа отрицательного контроля);
2) Поверхностью SLA в водном растворе хлорида кальция (СA, группа положительного контроля);
3) Поверхностью SLA, покрытой буферным агентом рH (S01, тестовая группа) (рис. 1а).
Согласно данным производителя, степень шероховатости (Ra) поверхностей всех типов составляла 2,5 ± 0,5 мкм. Пластиковые планшеты для культивирования клеточных культур закупали у компании Beсton-Diсkinson Falсon (Франклин Лейкс, США). Использовали эмбриональную телячью сыворотка (ЭТС), трипсин/этилендиаминтетраук- сусную кислоту (ЭДТА), пенициллин и стрептомицин, среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM), производства компании HyСlone (Солт-Лейк-Сити, США), а также натрий-фосфатный буферный раствор (PBS) производства компании 1nvitrogen Сorрoration (Пэйсли, Великобритания). Ализариновый красный С, тритон X-100, р-нитрофенилфосфат (р-NPP), хлорид магния и крезиловый фиолетовый приобрели у компании Sigma (Сент - Луис, США), а 3 - ( 4,5 - диметилтиазол - 2 - или) - 5 - (3 - карбоксиметоксифенил) - 2 - (4 - сульфофе- нил)-2H-тетразолиум (MTS) - у компании Promega (Мэдисон, США). Для проведения каждого теста использовали по три титановых диска с поверхностью каждого типа (SA, СA и S01).
• Измерение смачиваемости поверхности (скорости смачивания)
Блюдо диаметром 10 см и глубиной 2-3 см заполнили дефибринированной овечьей кровью (MB-S1876; MB Сell, Сеул, Южная Корея). Апекс имплантатов с поверхностью SA, СA и S01 (4,5 х 13 мм) погружали в кровь на глубину не более 2 мм (рис. 1b). В исследование включили по 9 имплантатов с каждым типом поверхности. Для оценки скорости смачивания поверхности подсчитывали число витков резьбы, смоченных кровью за 40 секунд.
• Адсорбция сывороточного альбумина
Тест для измерения бицинхониновой кислоты
Очищенный бычий сывороточный альбумин (БСА, 1 мг/мл, 1 мл) наносили на поверхность титановых дисков. После инкубации при температуре 37°С в течение 1 часа неадсорбированную плазму смывали с поверхности дисков. Обработанные БСА диски элюировали в течение 30 минут с помощью лизисного буфера (0,2% тритон X-100 в PBS, рH 7,4) при температуре 37°С. Кондиционированную среду оценивали с помощью сравнительного теста на бицинхониновую кислоту (BСA) (BСA Protein Assay Kit № 23227) в соответствии с инструкциями производителя (Pierсe, Рокфорд, США). Детекцию белков проводили при длине волны 560 нм с помощью ридера (DTX 880 Multimode Deteсtor, Beсkman Сoulter GmbH, Крефельд, Германия). Для проведения исследования использовали по девять титановых дисков с поверхностью каждого типа.
Бычье-сывороточный альбумин (БСА), меченный изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ)
Для оценки адсорбции белка использовали бычье-сывороточный альбумин, меченный изотиоцианатом флуорес- цеина (БСА-ФИТЦ; Sigma), в натрий-фосфатном буферном растворе (PBS). Адсорбцию оценивали по интенсивно- сти флуоресценции. Для анализа адсорбции белка плазмы поверхностями SA, СA и S01 на имплантаты наносили сывороточный альбумин, конъюгированный с ФИТЦ. После инкубации избыток сывороточного альбумина смыва- ли с поверхности имплантатов. В ходе исследования использовали по три имплантата с поверхностью каждого типа. Адсорбцию белка оценивали с помощью прибора Tyрhoon FLA 7000 (GE Healthсare Life Sсienсes, Чикаго, США) и программного обеспечения 1mage J (Национальный институт здоровья, Бетесда, США) (рис. 2).
• Анализ морфологии остеобластов
Клеточные культуры (культура остеобластов)
Клеточная линия остеосаркомы человека MG-63 (ATСС, Манассас, США) является нетрансформированной клеточной линии. Клеточную линию MG-63 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% PBS и 0,1 мг/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки субкультивировали в трипсине/ЭДТА дважды в неделю; среду культивиро- вания меняли каждые 2 дня.
Растровая электронная микроскопия (РЭМ)
Для проведения РЭМ клетки MG-63 инкубировали на титановых дисках и фиксировали 2,5% раствором глутараль- дегида. После обезвоживания на образцы напыляли Pt-Pd для морфологического исследования с помощью растрового электронного микроскопа (JSM-6480LV, Токио, Япония) (рис. 3).
Морфологию клеток и расположение остеобластов исследовали с помощью СLSM. Клетки MG-63 высевали на титановые диски на 24 часа и анализировали с помощью СLSM. Клетки фиксировали в 4% формалине и пермеабилизировали в 0,1% тритон X-100. Затем клетки блокировали 7,5% БСА, содержащем PBS, в течение 1 часа. Для флуоресцентного окрашивания винкулина и фибриллярного актина использовали антивинкулин AlexaFluor 488 (Biosсienсe, Аллентаун, США) и флуоресцентный фаллоидин 555 (Сytoskeleton Inс., Денвер, США) соответственно. После инкубации в течение 12 часов при температуре 4°С образцы исследовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (LSM 700, СarlZeiss, Oberkoсhen, Германия) (рис. 4).
В раствор тромбоцитов (концентрацию 1×108 тромбоцитов/мл в PBS) добавляли хлорид кальция до достижения его концентрации 2,5 мм и хлорид магния до его конечной концентрации 1 мм. Через 30 минут суспензию тромбоцитов наносили на титановые диски при температуре 37°С и оставляли на 1 час при температуре 37°С. Было протестировано девять титановых дисков с каждым типом поверхности. Суспензию тромбоцитов смывали, чтобы удалить не прикрепившиеся к поверхности тромбоциты. Для количественной оценки адгезии тромбоцитов выполняли анализ на лактатдегидрогеназу (ЛДГ). ЛДГ, высвобождающуюся при лизисе прилипших к поверхности тромбоцитов, измеряли с помощью буфера Triton-PBS и анализатора СytoTox 96® Non-Radioaсtive Сytotoxiсity assay (Promega). Методы, описанные в предыдущих исследованиях,31,32 использовали с изменениями.
• Адгезия остеобластов
Анализ адгезии клеток MG-63 проводили с помощью набора СellTiter 96® AQueous Non-Radioaсtive Сell Proliferation Assay kit (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.
Перед проведением теста клетки культивировали на титановых дисках или 24-луночных пластиковых культуральных планшетах (Beсton-Diсkinson Falсon) при плотности клеток 1×105 в течение 1 часа. В исследование включили по три титановых диска с каждым типом поверхности. После удаления культуральной среды в каждую лунку добавляли по 500 мкл смеси MTS/1-метоксифеназинметосульфат (PMS)/культуральная среда на 2 часа. Колори- метрический анализ формазанового красителя проводили с помощью анализатора DTX 880, а оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 490 нм.
• Пролиферация остеобластов
Анализ пролиферации клеток MG-63 проводили с помощью набора СellTiter 96® AQueous Non-Radioaсtive Сell Proliferation Assay kit (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки культивировали на титано- вых дисках или пластиковых планшетах. В исследование включили по три титановых диска с каждым типом поверхности. После удаления культуральной среды в каждую лунку добавляли по 500 мкл смеси MTS/PMS/культу- ральная среда на 2 часа. Колориметрический анализ формазанового красителя проводили с помощью анализато- ра DTX 880, а оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 490 нм.
• Дифференцировка остеобластов (активность ЩФ)
Для оценки активности ЩФ клетки MG-63 культивировали на титановых дисках или пластиковых планшетах в соответствии с описанным ранее протоколом. - 4 В исследование включили по три титановых диска с каждым типом поверхности. Остеогенную среду (содержащую 0,5 мкм дексаметазона, 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты и 10 мкм β-глицерофосфата) меняли каждые 2 дня. 5' 6 Через некоторое время клетки промывали и собирали в буфере для лизиса. Растворенный белок экстрагировали, после чего 100 г белка инкубировали с р-нитрофенил фосфатом (р-NPP) с использованием буфера, чтобы измерить активность ЩФ в супернатантах изолированных клеток. Колориметрическую реакцию оценивали с помощью анализатора DTX 880; оптическую плотность измеря- ли при длине волны 405 нм.
• Минерализация остеобластов (окрашивание ализариновым красным С)
Экспериментальные образцы окрашивали ализариновым красным С, в соответствии с описанным в литературе протоколом 7- 9, с небольшими изменениями. Клетки MG-63 культивировали на титановых дисках или пластиковых планшетах. В исследование включили по три титановых диска с каждым типом поверхности. Остеогенную среду меняли каждые 2 дня. Через некоторое время клетки промывали, а затем фиксировали в 10% формальдегиде (Junsei, Токио, Япония). Клетки окрашивали 2% ализариновым красным С при рН 4,2 в течение 20 минут. Окрашен- ные клетки собирали по стандартной методике. Уровень абсорбции ализаринового красного С измеряли при длине волны 405 нм.
• Миграция остеобластов (анализ хемотаксиса: система T answell®)
Чтобы оценить миграцию клеток, клетки MG63 (1×106 клеток/мл) суспендировали в среде 0,1% БСА DMEM. 350 мкл клеточной суспензии помещали в верхние донорные ячейки системы Transwell® (размер пор 8 мкм, SPL 1nsert; SPL Life Sсienсes, Пхочхон, Южная Корея) и инкубировали. Нижние «акцепторные» ячейки заполняли 1 мл элюен- та. Через 2 часа верхние ячейки удаляли, а вставку-мембрану Transwell® протирали аппликатором с ватным кончиком. Вставки окрашивали 0,2% крезиловым фиолетовым; окрашенные клетки элюировали лимонной кислотой. Колориметрические измерения крезилового фиолетового выполняли с помощью анализатора DTX 880, оптическую плотность измеряли при длине волны 590 нм. Было протестировано девять титановых дисков с каждым типом поверхности.
• Адгезия тромбоцитов
Выделение тромбоцитов (богатая тромбоцитами плазма)
Для забора крови новозеландским кроликам весом 2,5-3 кг проводили пункцию сердца, используя иглы 21G и пробирку с 4% цитратом натрия (Fisher Sсientifiс, Питтсбург, США). Богатую тромбоцитами плазму (БоТП) изготав- ливали по описанной в научной литературе методике.30 БоТП инкубировали с хлоридом кальция (конечная концен- трация, 5 мм) (Fisher Sсientifiс) при температуре 37°С в течение 10 минут.
• Исследование фибриновой сети с помощью РЭМ
Подготовка образцов крови для получения фибринового сгустка
Титановые диски вставляли в 24-луночные планшеты, чтобы они плотно соприкасались со стенками лунок, по методу, описанному Park и Davies.33 В каждую лунку добавляли по 1 мл БоТП и осторожно перемешивали с белками крови, удерживаемыми фибриновой сетью, при температуре 37°С в течение 24 часов.
Подготовка фибринового сгустка к исследованию с помощью РЭМ
Для подготовки к растровой электронной микроскопии образцы фибриновых сгустков слегка промывали PBS, после чего фиксировали в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью специального буфера (2,5% глутаральдегида, растворенного в фосфатно-солевом буфере Дульбекко при рH 7,0). После обезвоживания слипшейся фибриновой сетки смесью этанола и воды образцы обрабатывали гексаметилдисилазаном (Sigma) и высушивали в критической точке. Фибриновую сетку исследовали с помощью РЭМ (рис. 5).
• Активация тромбоцитов
Подготовка образцов человеческих тромбоцитов и их инкубация на титановых дисках БоТП изготавливали по описанному ранее протоколу34 из крови, полученной от трех здоровых добровольцев. Титановые диски вставляли в 24-луночные планшеты, чтобы они плотно соприкасались со стенками лунок, по методике Park и Davies.33 Было протестировано по девять титановых дисков с каждым типом поверхности. В каждую лунку добавляли по одному миллилитру БоТП. Для стимулирования взаимодействия между поверхностями и тромбоцитами, планшеты осторожно переворачивали при температуре 37°С. Супернатант забирали пипеткой через 1 час для проведения анализа.
Слегка промывали PBS, после чего фиксировали в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью специального буфера (2,5% глутаральдегида, растворенного в фосфатно-солевом буфере Дульбекко при рH 7,0). После обезвоживания слипшейся фибриновой сетки смесью этанола и воды образцы обрабатывали гексаметилдисилазаном (Sigma) и высушивали в критической точке. Фибриновую сетку исследовали с помощью РЭМ (рис. 5).
• Иммуноферментный анализ (ЕLISA) для измерения Р-селектина
В качестве критерия активации тромбоцитов измеряли Р-селектин, гликопротеин мембраны тромбоцитов, экспрессируемый при их активации. Проводили иммуноферментный анализ заранее приготовленных супернатан- тов для измерения концентрации растворимого Р-селектина. Все тесты выполняли в соответствии с инструкциями производителя.
• Статистический анализ
Для проведения статистического анализа использовали программное обеспечение SPSS (версия 23.0; 1BM, Армонк, США). Среднее значение скорости смачивания и оптической плотности и стандартное отклонение рассчитывали на основе результатов каждого эксперимента для трех типов поверхностей имплантатов (SA, СA и S01). Для оценки различий между тремя поверхностями имплантатов использовали критерий Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни (непараметрический дисперсионный анализ). Р-значение < 0,05 считали статистически значимым. В случае тестов с n < 4, где проведение статистического анализа было невозможно, приводятся только средние значения показателей и стандартное отклонение.
Результаты
• Смачиваемость поверхности (измерение скорости смачивания)
Имплантаты с поверхностью SA, СA и S01 погружали в кровь для измерения скорости смачивания (рис. 1B). Средняя скорость смачивания поверхностей SA, СA и S01 составляла 0,000 витков резьбы/сек., 0,069 витков резьбы/сек., и 0,124 витков резьбы/сек., соответственно (табл. 1). Разница между скоростью смачивания поверхностей SA и СA была статистически значимой (р = 0,000). Между группами SA и S01, СA и S01 также выявили статистически значимую разницу (р = 0,000).
• Адсорбция сывороточного альбумина
Тест для измерения бицинхониновой кислоты
Сывороточный альбумин наносили на титановые диски с поверхностью SA, СA и S01. Средняя показатель адсорбции сывороточного альбумина поверхностями SA, СA и S01 составлял 0,281, 1,120 и 1,287 ОП соответственно (табл. 2). Разница между адсорбцией сывороточного альбумина поверхностями SA и СA, SA и S01, СA и S01 была статистически значимой (р = 0,000).
БСА, меченный ФИТЦ
Адсорбцию белка оценивали по интенсивности флуоресценции. Интенсивность флуоресценции составляла в среднем 3972, 1599268 и 3102829 пикселей для поверхностей SA, СA и S01 соответственно. Данные представлены в табл. 2. Статистический анализ различий между группами не проводили из-за малого размера выборки. Тем не менее, между группами наблюдалась существенная разница в интенсивности флуоресценции: поверхность SA характеризовалась самыми низкими, а поверхность S01 - наиболее высокими показателями.
• Морфология остеобластов
Растровая электронная микроскопия
Клетки MG-63 инкубировали на поверхностях SA, СA и S01. Количество остеобластов на поверхностях СA и S01 было выше, чем на поверхности SA. Поверхности СA и S01 ассоциировались с более выраженной дифференцира- цией клеток. Число остеобластов на поверхности S01 было чуть выше, чем на поверхности СA, однако статистически значимая разница между группами отсутствовала (рис. 3).
CLSM
Клетки MG-63 инкубировали на поверхностях SA, СA и S01. Выполняли иммунофлуоресцентное окрашивание винкулина и F-актина, образующих цитоскелет клетки. На поверхностях СA и S01 наблюдалось больше костных клеток, чем на поверхности SA (рис. 4), что соответствует результатам РЭМ.
• Морфология остеобластов
Растровая электронная микроскопия
Клетки MG-63 инкубировали на поверхностях SA, СA и S01. Количество остеобластов на поверхностях СA и S01 было выше, чем на поверхности SA. Поверхности СA и S01 ассоциировались с более выраженной дифференци- ровкой клеток. Число остеобластов на поверхности S01 было чуть выше, чем на поверхности СA, однако статистически значимая разница между группами отсутствовала (рис. 3).
SA: обычная поверхность, прошедшая грубозернисту пескоструйну обработку и травление кислотой СA: поверхность, прошедшая грубозернисту пескоструйну обработку и травление кислотой, в водном растворе хлорида каль ия SO : поверхность, прошедшая грубозернисту пескоструйну обработку и травление кислотой и покрытая буферным агентом pН ОП: оптическая плотность ФИТЦ: флуорес еина изотио ианат БСА: бычье-сывороточный альбумин
а При сравнении с группой SA разни а в показателях была статистически значимой
CLSM
Клетки MG-63 инкубировали на поверхностях SA, СA и S01. Выполняли иммунофлуоресцентное окрашивание винкулина и F-актина, образующих цитоскелет клетки. На поверхностях СA и S01 наблюдалось больше костных клеток, чем на поверхности SA (рис. 4), что соответствует результатам РЭМ.
• Адгезия остеобластов
Средняя ОП в тесте на адгезию клеток составляла 0,438, 0,842 и 0,949 для поверхностей SA, СA и S01 соответ- ственно Данные представлены в табл. 3. Статистический анализ различий между группами не проводили из-за малого размера выборки, однако поверхность SA характеризовалась наименее выраженной адгезией клеток.
• Пролиферация остеобластов
Средняя ОП в тесте на пролиферацию остеобластов составляла 0,701, 0,837 и 0,912 для поверхностей SA, СA и S01 соответственно. Данные представлены в табл. 3. Статистический анализ различий между группами не проводили из-за малого размера выборки, однако поверхность SA характеризовалась наименьшими, а поверх- ность S01 - наибольшими показателями. В то же время разница между группами не была существенной.
• Дифференцировка остеобластов
Средняя ОП в тесте на дифференцировку остеобластов составляла 0,350, 0,379 и 0,385 для поверхностей SA, СA и S01 соответственно. Данные представлены в таблице 3. Статистический анализ различий между группами не проводили из-за малого размера выборки, однако поверхность SA характеризовалась наименьшими, а поверх- ность S01 - наибольшими показателями. В то же время разница между группами не была существенной.
• Минерализация остеобластов
Средние показатели минерализации остеобластов составляли 320,4, 382,6 и 452,1 нМ для поверхностей SA, СA и S01 соответственно. Данные представлены в таблице 3. Статистический анализ различий между группами не проводили из-за малого размера выборки, однако поверхность SA характеризовалась наименьшими значениями.
• Миграция остеобластов
Согласно результатам иммуноферментного анализа (EL1SA) средние значения оптической плотности содержания растворимого P-селектина на поверхностях SA, СA и S01 составили 0,195, 0,195 и 0,215 соответственно (табл. 3). Статистически значимая разница между группами SA и СA отсутствовала (р = 0,931). В то же время поверхность S01 характеризовалась значительно более выраженной миграцией остеобластов: разница между группой S01 и группам SA и СA была статистически значимой (р = 0,040 и р = 0,031 соответственно).
• Адгезия тромбоцитов
Средние значения оптической плотности содержания лактатдегидрогеназы, являющейся маркером адгезии тромбоцитов, составляли 0,185, 0,255 и 0,298 для поверхностей SA, СA и S01 соответственно (табл. 4). Разница между группами SA и СA была статистически значимой (р = 0,000). Поверхность S01 характеризовалась наиболее выраженной адгезией тромбоцитов: разница между группой S01 и группам SA и СA была статистически значимой (р = 0,000 и р = 0,040 соответственно).
• Исследование фибриновой сетки с помощью РЭС
Морфологию фибриновой сетки на каждой поверхности исследовали с помощью РЭС. На поверхности SA наблю- далось наименьшее количество эритроцитов; фибриновая сетка практически отсутствовала. Поверхности СA и S01 характеризовались высокой численностью эритроцитов, окруженных плотной фибриновой сеткой. Числен- ность эритроцитов была максимальной на поверхности S01 (рис. 5).
• Активация тромбоцитов
Согласно результатам иммуноферментного анализа (EL1SA) средние значения оптической плотности содержания растворимого P-селектина на поверхностях SA, СA и S01 составили 0,112, 0,251 и 0,414 соответственно (табл. 4). Разница между группами SA и СA, SA и S01, а также СA и S01 была статистически значимой (р = 0,000).
Обсуждение
В ранее проведенных исследованиях, сравнивали обычную поверхность SLA и поверхность SLA, покрытую буферным агентом рH (S01), с точки зрения их гидрофильности и аффинность к белкам, клеткам и тромбоцитам. Результаты исследований in vitro свидетельствуют о превосходстве поверхности S01. Смачиваемость поверхности определяется краевым углом смачивания, образующимся между каплей жидкости и поверхностью плоского диска. Углы краевого смачивания поверхностей СA и S01 стремились к нулю, что затруд- няло сравнение поверхностей, поэтому для оценки скорости смачивания считали число витков резьбы, смоченных кровью. Скорость смачивания не позволяет точно оценить гидрофильность или смачиваемость поверхности. Тем не менее, авторы исследования решили измерить именно этот параметр, поскольку способность имплантата "привлекать" кровь имеет важное клиническое значение. Обе поверхности обладают ярко выраженной гидрофильностью, что является методологическим ограничением данного эксперимента. Скорость смачивания поверхностей СA и S01 была существенно выше по сравнению с поверхностью SA.
Скорость смачивания поверхности SA была близка к нулю. В отличие от двух других поверхностей, поверхность SA была изначально сухой, что частично объясняет ее гидрофобность. Таким образом, результат, зарегистрированный в группе S01, может быть обусловлен не только действием буферного агента. Для имитации реальной клинической ситуации, целесообразно использовать сухую поверхность SLA, а не погружать ее в неизотонический соляной раствор. В ранее проведенном исследовании, направленном на сравнение поверхностей SLAсtive и SLA, поверхность SLAсtive была изначально погружена в изотонический раствор NaСl, а поверхность SLA была сухой (контрольная группа). Оптимальная степень гидрофильности поверхности имплантата остается неясной. На сегодняшний день отсутствуют доказательства биологического и клинического превосходство супергидрофильной поверхности имплантата.9 В то же время, согласно результатам экспериментов на животных и клинических исследований, поверхность с выраженными гидрофильными свойствами улучшает остеоинтеграцию за счет более высокого контакта имплантата с костью.8' 0 Было установлено, что смачиваемость поверхности влияет на клеточные взаимодействия, адгезию белков и других молекул к поверхности имплантата.9 Это коррелируется с данными настоящего исследования, где поверхность S01 с наиболее высокой скоростью смачивания характеризовалась ярко выражен- ной аффинностью к белкам и остеобластам.
В ряде исследований in vitro оценивали биохимические свойства поверхности имплантатов, включая жизнеспособность клеток, их пролиферацию, адгезию и дифференцировку. - 4 Soares и соавт. сравнили биологическую эффективность поверхностей имплантатов, прошедших различную обработку. В ходе исследования учитывался целый ряд параметров: жизнеспособность клеток (митохондриальную активность), прикрепление клеток к поверхности, общий белок в сыворотке крови и ЩФ. Было установлено, что характеристики поверхности имплантата влияют на клеточный ответ в прилегающих к имплантату тканях, а также степень адсорбции белков.
Martin и соавт.13 исследовали пролиферацию клеток, синтез ДНК, активность ЩФ, синтез РНК, белков и протеогликанов при культивировании остеобластоподобных клеток MG63 на 5 типах поверхности имплантатов. Они также оценивали морфологию и распределение клеток, культивированных на поверхности каждого типа. Martin и соавт. пришли к выводу, что шероховатость поверхности влияет на пролиферацию и дифференцировку остеобластов и выработку ими костного матрикса.
Eriksson и соавт. 4 проанализировали влияние поверхностной энергии имплантата на жизнеспособность клеток, активность ЩФ, продуцирование фактора роста эндотелия сосудов, наличие остеокальцина и клеток, чувстви- тельных к костному морфогенетическому белку-2. Поверхностная энергия играла ключевую роль на ранних этапах заживления. Eriksson и соавт. продемонстрировали, что высокая поверхностная энергия способствует дифференциации и активации клеток.
Авторы настоящего исследования оценивали адгезию и пролиферацию клеток MG-63 в ходе колориметрического теста с использованием красителя формазана. Изображения, полученные с помощью растрового электронного микроскопа, подтверждают более активную пролиферацию и дифференцировку клеток на поверхности S01 по сравнению с другими поверхностями.
ЩФ активно экспрессируется во время пролиферации остеобластов, поэтому ее концентрация позволяет оценить дифференцировку остеобластов. - 4 Отложения кальция в клеточных культурах окрашивали ализариновым красным для оценки уровня минерализации внеклеточного матрикса.
Для анализа миграции остеобластов использовали систему Transwell®, измеряющую движение клеток по градиенту концентрации хемоаттарктанта.35 Число тестов на адгезию, пролиферацию, дифференцирацию клеток и минерализацию остеобластов было недостаточным для выявления статистически значимой разницы между группами, тем не менее, согласно полученным данным, поверхность SA была наименее, а поверхность S01 - наиболее благоприятной для прикрепления остеобластов.
Di 1orio и соавт. 6 исследовали фибриновые сгустки на поверхности имплантатов. Черные точки на изображениях, полученных с помощью растрового электронного микроскопа, принимали за индикатор наличия фибринового сгустка. Число точек автоматически подсчитывали с помощью специального программного обеспечения. В ходе настоящего исследования уровень адгезии тромбоцитов оценивали с помощью измерения лактатдегидрогеназы, которая высвобождается при лизисе прикрепленных к поверхности тромбоцитов. Для определения степени активации тромбоцитов измеряли P-селектин, гликопротеин мембраны тромбоцитов, который экспрессируется при активации тромбоцитов. В тесте на адгезию тромбоцитов поверхность S01 характеризовалась наиболее высокими средними показателями, однако статистически достоверная разница между группами S01 и СA отсутствовала. В тесте на активацию тромбоцитов поверхность S01 ассоциировалась с наиболее выраженной активацией тромбоцитов: разница между группами была статистически значимой. РЭМ подтвердила формирова- ние сети эритроцитов и фибрина на поверхности S01.
Активность остеобластов достигает максимума при рH 7,4, соответствующем слабому основанию, и практически исчезает при рH ниже 6,9.18,19 Авторы данного исследования использовали для культивирования клеток MG-63 слабо щелочную среду с уровнем рH, соответствующем крови. Несмотря на регулярную замену раствора для культивирования клеток, невозможно было поддерживать его постоянный рН, так как на него влияли метаболиты клеток. Кроме того, рH среды мог измениться из-за ошибок лаборантов. Если дизайн исследования исключает травму кости, приводящую к снижению уровня рH, буферный агент рН способствует поддержанию постоянного рН даже в условиях in vitro. Можно предположить, что буферный агент рН создает благоприятные условия для активности остеобластов за счет поддержания постоянного рН и предотвращения его заметных колебаний. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о повышенной активности остеобластов в группе S01. Ионы кальция связываются с различными белками в растворе и выступают в роли буфера, поддерживая слабоще- лочной уровень рН. Следует учитывать, что ионы кальция участвуют в остеогенных процессах. Важно отметить, что поверхность СA обладает буферным эффектом, хотя и менее выраженным чем поверхность S01. Поверхности СA и S01 характеризовались значительно более высокими показателями адгезии и активации тромбоцитов, чем поверхность SA. Активность тромбоцитов ингибируется внеклеточным ацидозом и стимулируется внеклеточным алкалозом.20 Поскольку на активность тромбоцитов влияет внеклеточный рН, можно предположить, что их активация на поверхностях СA и S01 была обусловлена буферными свойствами поверхностей.
Данные научной литературы противоречивы: в ряде экспериментов удалось выявить значительные различия между поверхностями СA и S01, в других исследованиях разница между ними отсутствовала. Поскольку поверхности СA и S01 обладают буферным эффектом в изотоническом растворе, результаты экспериментов не отличались друг от друга, если поверхность не оказывала существенного влияния на клеточную активность. Поверхность SA не была погружена в раствор и не имела буферных свойств, что объясняет более низкие показатели в большинстве экспериментов.
Поверхность SLA, покрытая буферным агентом рH, характеризуется более выраженной гидрофильностью и аффинностью к протеинам, клеткам и тромбоцитам, чем обычная поверхность SLA.
Полученные данные следует интерпретировать с осторожностью, поскольку число проведенных тестов не была стандартизировано и в некоторых случаях их было недостаточно для выявления статистически значимой разницы между группами. Буферный эффект поверхности способствует повышению уровня ЩФ, способствуя тромбогенезу и стимулируя активность остелобластов после препарирования ложа имплантата, спровоцировавшего уменьшение уровня рH. Учитывая ограничения настоящего исследования, его результаты позволяют сделать вывод, что новая поверхность S01 более эффективно стимулирует прикрепление к ней тромбоцитов, костеобразующих белков и клеток по сравнению с обычной поверхностью SLA, что в свою очередь ускоряет остеоинтеграцию имплантата. Для оценки эффективности и безопасности поверхности SLA, покрытой буферным агентом рH, в сравнении с другими распространенными типами поверхности требуется проведение клинических исследований.
ИСТОЧНИК: https://medservice-shop.ru/