Технология hybridoma - это метод получения большого количества идентичных антител (также называемых моноклональными антителами).
Этот процесс начинается с введения мыши (или другому млекопитающему) антигена, который провоцирует иммунный ответ. Тип белых кровяных клеток, В-клетка, продуцирует антитела, которые связываются с введенным антигеном. Эти антитела, продуцирующие В-клетки, затем собираются у мыши и, в свою очередь, сливаются с бессмертными клетками рака В-клеток, миеломой, чтобы произвести гибридную клеточную линию, называемую гибридомой, которая обладает как антителопродуцирующей способностью В-клетки, так и долговечностью и репродуктивностью миеломы. Гибридомы могут быть выращены в культуре, каждая культура начинается с одной жизнеспособной гибридомной клетки, производя культуры, каждая из которых состоит из генетически идентичных гибридом, которые производят одно антитело на культуру (моноклональную), а не смеси различных антител (поликлональных). Клеточная линия миеломы, которая используется в этом процессе, выбрана за ее способность расти в культуре тканей и за отсутствие синтеза антител. В отличие от поликлональных антител, которые представляют собой смеси множества различных молекул антител, моноклональные антитела, продуцируемые каждой линией гибридомы, химически идентичны.
Лабораторные животные (млекопитающие, например, мыши) сначала подвергаются воздействию антигена, против которого должно быть выработано антитело. Обычно это делается серией инъекций рассматриваемого антигена в течение нескольких недель. Эти инъекции обычно сопровождаются использованием электропорации in vivo, которая значительно усиливает иммунный ответ. Как только спленоциты выделяются из селезенки млекопитающего, В-клетки сливаются с увековеченными клетками миеломы. Слияние В-клеток с клетками миеломы может быть выполнено с помощью электрофузии. Электрофузия заставляет В-клетки и клетки миеломы выравниваться и сливаться с применением электрического поля. Альтернативно, В-клетки и миеломы могут быть слиты химическими протоколами, чаще всего с использованием полиэтиленгликоля. Клетки миеломы отбираются заранее, чтобы убедиться, что они сами не секретируют антитела и что у них отсутствует ген гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT), что делает их чувствительными к среде HAT.
Слитые клетки инкубируют в среде HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидиновая среда) в течение примерно 10-14 дней. Аминоптерин блокирует путь, который позволяет синтезировать нуклеотиды. Следовательно, несросшиеся клетки миеломы умирают, так как они не могут продуцировать нуклеотиды de novo или спасательными путями, потому что у них нет HGPRT. Удаление несросшихся клеток миеломы необходимо, потому что они могут перерасти другие клетки, особенно слабо установленные гибридомы. Несмешанные В-клетки умирают, поскольку они имеют короткую продолжительность жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клеток-миеломы, поскольку ген HGPRT, поступающий из В-клеток, является функциональным. Эти клетки продуцируют антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство клеток миеломы). Затем инкубированную среду разбавляют на многолуночные пластины до такой степени, что каждая скважина содержит только одну клетку. Поскольку антитела в лунке вырабатываются одной и той же В-клеткой, они будут направлены к одному и тому же эпитопу и, таким образом, являются моноклональными антителами.
Получение моноклональных антител (но Милыптейну, 1982)
Следующим этапом является быстрый процесс первичного скрининга, который выявляет и отбирает только те гибридомы, которые продуцируют антитела соответствующей специфичности. Первый используемый метод скрининга называется ИФА. Супернатант культуры гибридомы, вторичный фермент, меченый конъюгатом, и хромогенный субстрат, затем инкубируются, и образование цветного продукта указывает на положительную гибридому. Альтернативно, иммуноцитохимическое,вестерн-блот и иммунопреципитация-масс-спектрометрия. В отличие от вестерн-блот-анализов, иммунопреципитация-масс-спектрометрия облегчает скрининг и ранжирование клонов, которые связываются с нативными (неденатурированными) формами антигенных белков. Скрининг проточной цитометрии был использован для первичного скрининга большого количества (~1000) клонов гибридомы, распознающих нативную форму антигена на поверхности клетки. В скрининге на основе проточной цитометрии в качестве антигена используется смесь антиген-отрицательных клеток и антиген-положительных клеток, подлежащих тестированию для каждого образца супернатанта гибридомы.
В-клетка, которая производит желаемые антитела, может быть клонирована для получения многих идентичных дочерних клонов. Дополнительные среды, содержащие интерлейкин-6 (такие как бриклон), необходимы для этого этапа. Как только колония гибридомы будет создана, она будет постоянно расти в культуральной среде, такой как RPMI-1640 (с антибиотиками и фетальной бычьей сывороткой) и вырабатывать антитела.
Многолуночные пластины используются первоначально для выращивания гибридом, а после селекции заменяются более крупными колбами для культуры тканей. Это поддерживает благополучие гибридом и обеспечивает достаточное количество клеток для криоконсервации и супернатанта для последующих исследований. Культивируемый супернатант может давать от 1 до 60 мкг/мл моноклонального антитела, которое поддерживается при -20 °C или ниже до тех пор, пока это не потребуется.
Используя культуральный супернатант или очищенный препарат иммуноглобулина, можно провести дальнейший анализ потенциального моноклонального антитела, продуцирующего гибридому, с точки зрения реактивности, специфичности и перекрестной реактивности.