Это открытие позволит разработать новые препараты и методики защиты поврежденных клеток периферической нервной системы от гибели. Исследование проведено в рамках программы развития ДГТУ Приоритет 2030 и входит в стратегический проект «Институт живых систем».
Биологи ДГТУ совместно с коллегами из ЮФУ и РостГМУ доказали, что оксид азота модулирует уровень белка p53 в нейронах и глиальных клетках при повреждении периферической нервной системы и является фактором негативного воздействия на клетку, впоследствии приводящего к ее апоптотической (запрограммированной) гибели, в частности через активацию белка p53 – ключевого белка клеточной смерти.
Полученные исследовательской группой данные позволяют рассматривать NO как потенциальную молекулярную мишень для нейропротекторной терапии в условиях нейротравмы. Что открывает широкие перспективы для создания инновационных терапевтических методик и клинически эффективных нейропротекторных препаратов, способных защитить поврежденные клетки нервной системы от гибели. Эти данные легли в основу кандидатской диссертации старшего преподавателя кафедры «Биоинженерия» ДГТУ, к.биол.н. Станислава Родькина. В рамках продолжения темы он подал заявку на грант Российского научного фонда (РНФ) и готовит заявку на внутренний грант ДГТУ.
– Перед нами стояли серьезные научные цели и задачи, к работе были привлечены специалисты из РостГМУ и Академии биологии и биотехнологии ЮФУ. Нейробиология будет активно развиваться на нашей кафедре благодаря покупке конфокального микроскопа, который значительно расширит наши научные возможности и вдохнет новые идеи в коллектив, – рассказала заведующий кафедрой «Биоинженерия» ДГТУ, д.биол.н. Евгения Кириченко.
По словам ученых ДГТУ, это научное открытие вносит существенный вклад в понимание фундаментальных механизмов выживания нервных и глиальных клеток в условиях механического повреждения, а также поможет в разработке новых эффективных нейропротекторов.
– Целью исследования было изучение действия оксида азота на локализацию и экспрессию белков, ответственных за гибель/выживание нервных и глиальных клеток в результате перерезки седалищного нерва, – пояснил Станислав Родькин. – Подобные нейротравмы, разрывы периферических нервов, являются частыми причинами инвалидности и смерти во всем мире. Ключевым моментом исследования стало изучение роли NO в экспрессии и локализации белка р53, определяющего клеточную судьбу, в нейронах и окружающих глиальных клетках при аксотомии, то есть при тотальной перерезке нерва. Кроме этого, нам удалось установить, что NO ответственен за гибель этих клеток в условиях аксонального стресса. Показанный механизм NO-зависимой регуляции р53 в клетках нервной ткани при аксотомии был продемонстрирован впервые.
Исследование проводилось на взрослых крысах-самцах в соответствии со всеми международными и региональными требованиями по биоэтике.
– Оксид азота – универсальная сигнальная молекула, выполняющая множество функций в организме, включая модулирование различных процессов в нервной ткани в норме и при патологических состояниях. В малых дозах необходим и полезен, в больших вреден, так как имеет свободнорадикальную природу – агрессивен в отношении других молекул, может нарушать их структуру и вызвать в организме окислительный стресс, – отметил Станислав Родькин.
В обычном состоянии оксид азота (NO) представляет собой газ. В живом организме он отвечает за множество разнообразных процессов: формирование памяти, репарацию ДНК, выживание нейронов и глиальных клеток и т. д.
В ходе исследования ученые провели анализ экспрессии апоптотического белка р53, ответственного за клеточную смерть – запрограммированную гибель клеток, апоптоз (см. справку), в клетках задних корешков спинного мозга крысы.
– Так называемый «страж генома» – белок p53, контролирующий более 3 000 различных генов, ответственных за выживание или гибель клеток. Также он регулирует рост и дифференцирование клеток и является супрессором опухоли – дает понять клетке, что нужно запустить процесс самоуничтожения, чтобы остановить процесс ракового перерождения клетки, с целью не допустить развития опухолевого заболевания, – уточнил Станислав Родькин. – При травмах периферических нервов, связанных с их разрывом, белок р53 обычно ассоциирован с проапоптотическими процессами, ведущими к гибели нервных и глиальных клеток. Особый интерес представляют NO-зависимые сигнальные механизмы регуляции данного белка.
Ученый отмечает, что p53, кроме транскрипционного пути – активации генов, может связываться с белками митохондрий – внутриклеточные органеллы, так называемые энергетические станции клеток – и приводить к нарушению проницаемости их мембран, что ведет к выходу апоптотических факторов, запускающих клеточную гибель. В нормальных условиях уровень p53 в клетке минимален и не наносит ей вреда.
При перерезке седалищного нерва происходит повреждение аксона, что может привести к гибели поврежденного нейрона. Возможны два варианта исхода: гибель или выживание нейрона и окружающих глиальных клеток. В периферической нервной системе может выжить до 30% аксотомированных нейронов в отличие от центральной нервной системы, где гибель неминуема. Процент выживаемости, утверждают биологи, можно повысить за счет разработки и применения клинически эффективных нейропротекторных препаратов, которые, к сожалению, пока не найдены.
– В нейронах дорзальных ганглиев, поврежденных после перерезки седалищного нерва, наблюдался выход белка p53 из ядра в цитоплазму, что может свидетельствовать об активации апоптотической гибели клетки. Клеточную гибель оценивали через 24 часа и 7 суток. Экспрессия белка р53 (см. справку) анализировалась через 4 и 24 часа, так как после травмы изменение уровня данного белка происходит стремительно, – говорит Станислав Родькин.
Ученые проводили перерезку седалищного нерва (повреждение аксона нейрона), тем самым происходила аксотомия нейронов в дорзальных ганглиях (скопление нейронов). Затем исследователи хирургическим путем извлекали дорсальные ганглии (ганглии задних корешков спинного мозга), содержащие в себе тела сенсорных нейронов и окружающие их глиальные клетки.
В результате экспериментов, проведенных на трех группах животных, включая контрольную, было показано, что NO-донор увеличивает гибель нейронов и глиальных клеток при аксотомии, тогда как селективный ингибитор iNOS проявляет выраженный цитопротекторный эффект – защищает клетки от апоптотической гибели.
– В исследовании нам удалось выявить также накопление фермента iNOS не только в цитоплазме, но и в ядре клеток дорзальных ганглиев крысы в ранние и более поздние сроки после травмы. Это может свидетельствовать о роли iNOS в регулировании уровня р53 в нейронах и глиальных клетках при аксональном стрессе, – объяснил Станислав Родькин.
Таким образом, полученные результаты дополняют знания о фундаментальных механизмах выживания нейронов при нейротравмах, а также могут быть использованы при разработке клинически эффективных нейропротекторных препаратов.
Кроме того, ученые планируют ряд исследований по теме на кафедре «Биоинженерия» ДГТУ в рамках новой образовательной программы «Биоинженерия и биоинформатика».
В исследовании приняли участие 3 научных коллектива: факультет «Биоинженерия и ветеринарная медицина» ДГТУ, Академия биологии и биотехнологии ЮФУ, а также кафедра общей и клинической биохимии № 2 РостГМУ.
Исследование «NO-Dependent Mechanisms of p53 Expression and Cell Death in Rat’s Dorsal Root Ganglia after Sciatic-Nerve Transection» было опубликовано издательством MDPI (Швейцария) в престижном международном журнале Biomedicines (Q1) от 11 июля 2022 года, том 10, выпуск 7.
С подробностями проведенных экспериментов можно ознакомиться в справочном материале.
С полным текстом статьи можно ознакомиться по ссылке.
Справочный материал.
Подробности эксперимента:
В проведенном эксперименте первой группе крыс вводили NO-донор (нитропруссид натрия), дающий в процессе метаболизма оксид азота (NO). Применение данного вещества приводило к ядерному депонированию проапоптотического белка р53 в поврежденных нервных и глиальных клетках, что свидетельствует о роли NO-зависимых сигнальных механизмов в этом процессе.
Второй группе вводили селективный ингибитор индуцибельной NO-синтазы (iNOS) – вещество, подавляющее активность фермента (iNOS), ответственного за синтез оксида азота. Применение данного вещества приводило к уменьшению уровня р53 в ядре и цитоплазме поврежденных нервных клеток.
Контрольной группе испытуемых животных вводили физиологический раствор.
Во всех трех группах производили перерезку седалищного нерва с правой стороны с последующей декапитацией животных и выделением ганглиев задних корешков спинного мозга для анализа экспрессии исследуемых белков и оценки клеточной гибели.
Исследование экспрессии и локализации белков проводилось с помощью современных методов молекулярной биологии: иммунофлуоресцентная микроскопия (принцип метода основан на взаимодействии антитела с антигеном, с последующей визуализацией при определенной длине волны света) и вестерн-блот анализ (разделение белков в электрофоретическом поле с последующим их переносом с геля на мембрану и детекции с помощью антител к исследуемым белкам).
Во время исследования применялся также метод TUNEL, маркирующий небольшие разрывы ДНК, характерные для апоптотической гибели клеток. С помощью него была наглядно продемонстрирована NO-зависимая клеточная гибель. Для подтверждения этих результатов была изучена экспрессия проапоптотического белка BAX и антиапоптотического белка Bcl-2. Исследования показали, что в поврежденных клетках увеличивается количество белка BAX, что свидетельствует об активации апоптотических процессов. Причем применение NO-донора увеличивало соотношение BAX\Bcl-2 в поврежденных клетках дорзальных ганглиев, а использование селективного ингибитора iNOS вызывало противоположный эффект.
Термины:
Нейротрансмиттеры – это химические передатчики сигналов между нейронами и от нейронов на эффекторные (исполнительные) клетки.
Апоптоз – регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной.
Аксон – отросток нейрона, передающий информацию.
Аксотомия – перерезка аксона.
Экспрессия белка – синтез белков в клетке под контролем соответствующих генов.