Два различных основных метода получили широкое распространение в лабораторных условиях для определение содержания белка в продуктах питания и кормах. Это химический метод Кьельдаля, а также метод высокотемпературного сжигания Дюма. Спектроскопия в ближнем инфракрасном диапазоне (БИК) может использоваться как вторичный метод анализа, но данный анализ требует первичного метода калибровки.
Более века vетод Кьельдаля был наиболее часто применяемым методом и являлся отраслевым стандартом для определения общее содержание белка в пищевых продуктах путем измерения общего содержания органического азота.
Как анализ с использованием жидких реактивов, он требует чрезмерных затрат времени и рабочей силы и подразумевает использование токсичных и опасных химикатов. В настоящее время это нежелательно по соображениям безопасности, а так же с экономической точки зрения. Как следствие, в последнее время метод Кьельдаля все чаще заменяется методом Дюма.
Основываясь на сгорании исследуемого материала и измерении образующегося элементарного азота, метод Дюма набирает все большую популярность в пищевых лабораториях благодаря своей скорости и надежности.
В этом сценарии «Программы проверки квалификации» организованы такими учреждениями, как BIPEA* позволяют сравнивать результаты нескольких лабораторий, чтобы оценить их аналитические характеристики на одном и том же однородном образце с применением различных методов. Регулярно участвуя в таких программах, любой производитель оборудования может осуществить проверку своих приборов. Образцы, предоставленные BIPEA, анализируются в соответствии с официальными рекомендациями, а полученные результаты сравниваются с заданным диапазоном допусков.
* — европейская некоммерческая организация, расположенная во Франции. Собрав около 2500 лабораторий в мире (в 120 странах), она предлагает более 150 регулярных программ тестирования.
Результаты, опубликованные в данной статье, действительно получены на различных образцах корма, предоставленных BIPEA в рамках специального межлабораторного исследования.
Определение белка
Чтобы определить количество белков можно проанализировать образец в соответствии с методами Дюма или Кьельдаля. Оба являются основными методами, работающими в соответствии с международными стандартами, такими как: AOAC, AACC, ASBC, ISO, IFFO, OIV.
Метод Дюма для определения азота, разработанный в 1831 г., старше, чем метод Кьельдаля, разработанный в 1883, но более удобен во многих аспектах, таких как скорость, безопасность, чистота, производительность и стоимость анализа.
Проблема в прошлом заключалась в том, что было непросто воспроизвести условия, требуемые методом Дюма, и по этой причине метод Кьельдаля взял на себя инициативу и стал считаться классическим методом определения азота/белка.
В настоящее время, благодаря прогрессу, определение азота по Дюма становится все более распространенным.
Результаты, полученные с помощью определения азота по Дюма обычно немного выше, чем у Кьельдаля поскольку обнаруживаются соединения азота, такие как нитраты, нитриты и гетероциклические соединения.
В методе Кьельдаля, такие соединения не полностью или совсем не переходят в аммониевый ион. Может случиться и обратное (редко), потому что в этом виде анализа есть множество переменных, которые могут повлиять на конечный результат.
Действительно, существует множество незначительных вариантов метода Кьельдаля, включающих использование различных катализаторов, время нагрева, объёмы и распределение серной кислоты и массы исследуемой пробы: это показывает, что на процедуру Кьельдаля могут влиять экспериментальные ошибки. Восстановление одинаково для обоих методов (≥ 99,5%), в то время как предел обнаружения для Дюма ниже, чем для Кьельдаля (0,001 мг N абсолютного против ≥ 0,1 мг N абсолютного).
Метод Дюма
Принцип метода Дюма заключается в преобразовании азота, присутствующего в образце, в газообразный NOx путем полного сгорания в печи, поддерживаемой при температуре 950–1100°C. Конечный продукт (NOx) затем восстанавливается до N2 и измеряется с помощью детектора теплопроводности.
Метод Дюма начинается с печи сжигания (CF) для сжигания образца с получением элементарных соединений. Вода удаляется с помощью первой физической ловушки (WT1) и второй химической ловушки (WT2). Между ними элементарные вещества проходят через восстановительную печь (RF). Авторегенеративные поглотители CO2 пропускают только элементарный азот, который обнаруживается детектором теплопроводности (TCD).
Метод Кьельдаля
Метод Кьельдаля заключается в процедуре каталитически поддерживаемой минерализации органического материала в кипящей смеси серной кислоты и сульфатной соли при температурах разложения выше 400°C. Во время процесса органически связанный азот превращается в сульфат аммония. Подщелачивание сброженного раствора высвобождает аммиак, который подвергается количественной перегонке с водяным паром и определяется титрованием.
Этап 1. Подготовка образца
- гомогенизация
- взвешивание
- добавление серной кислоты и катализатора KjTabs.
Этап 2. Разложение
- конфигурация системы разложения с системой нейтрализации паров и насосом
- настройка метода (изменение времени и температуры)
- разложение при 420°C
- охлаждение.
Этап 3. Дистилляция
- Vreceiver подготовка борной кислоты и добавление в приемную колбу
- размещение пробирки с образцом
- настройка метода дистилляции
- добавление H2O — NaOH — Vreceiver (доступен различный уровень автоматизации)
- удаление остатков (доступен различный уровень автоматизации).
Этап 4. Титрование
- ручное или автоматическое
- колориметрическое титрование согласно AOAC в автоматических дистилляционных установках
- для некоторых моделей доступно внешнее потенциометрическое титрование (электрод требует периодической калибровки).
Сравнение методов
Главные преимущества метода Дюма это простота использования, скорость, безопасность и высокий уровень автоматизации, гарантирующий автоматическую работу в лаборатории. Метод Дюма занимает всего несколько минут на одно измерение, что делает его значительно быстрее, чем анализ Кьельдаля, который обычно занимает более часа. Более того, избегая использования токсичных и потенциально вредных химикатов или катализаторов, метод Дюма обеспечивает полную безопасность для операторов
лаборатории.
С другой стороны, Метод Кьельдаля использует концентрированную серную кислоту и катализатор для разложения образца.
Поскольку в 1990-х годах начали применяться строгие стандарты в отношении использования вредных химикатов, многие лаборатории оценили метод Дюма как альтернативу, и были разработаны и опубликованы многочисленные сравнительные исследования. Был разработан ряд международных стандартов, а также зерновые инспекционные службы США, Канады и Австралии признали
Метод Дюма.
- ISO 16634-1: 2008. Пищевые продукты — Определение общего содержания азота путем сжигания в соответствии с принципом Дюма и расчет содержания сырого протеина — Часть 1: Масличные семена и корм для животных.
- Метод AACC 46.30. Сырой протеин — метод сжигания (корма для животных, зерновые и масличные).
- Стандарт ICC № 167. Определение сырого протеина в зерне и зерновых продуктах для пищевых продуктов и кормов по принципу сжигания Дюма.
- AOAC 990.03. Белок (сырой) в кормах для животных — метод сжигания.
- AOAC 992.23. Сырой протеин в зерновых и масличных культурах.
- AOCS Ba 4f-00. Метод сжигания для определения 00-f4 aB SCOAсырого протеина.
Основные преимущества метода сжигания Дюма включают:
- Легкость в эксплуатации — при использовании метода Дюма вам просто нужно завернуть образец непосредственно в оловянную фольгу и загрузить его в анализатор.
- Безопасность оператора — метод Дюма избегает использования опасных
химикатов, необходимых для метода Кьельдаля. - Сокращенное время анализа — от 2 часов (Кьельдаль), от 4 минут на образец (Дюма).
- Безотходное производство.