Начинаем публикацию вебинара о Thermo FS. Первая часть на сегодня - о вестерн-блоттинге.
Вестерн-блоттинг – высокочувствительный метод определения в смесях (образцах) специфичных белков при помощи антител. Суть метода в первоначальном разделении белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим переносом на мембрану, на которой их детектируют с помощью специфичных к конкретному белку антител.
Для всех стадий этого процесса ThermoFisher Scientific предлагает свои аппаратные решения.
Так, для первоначальной обработки проб с целью выделения белков у ThermoFS есть несколько разных наборов, в частности доступно выделение на магнитных частицах и автоматизация этого процесса через прибор Kingfisher Apex.
Далее смесь, содержащую белки, необходимо «разогнать» с помощью электрофореза на геле. Подготовку такого геля проводят двумя путями: на рынке доступны готовые предварительно залитые гели, к которым нужно добавить соответствующие маркеры, пробы – и можно начинать гель-электрофорез. Но заливку геля можно выполнить самостоятельно.
ThermoFS предлагает систему для заливки гелей под названием SureCast Gel Handcast Station.
Ее преимущество в едином спейсере, в чем можно убедиться, если достать сами стекла. Благодаря этому в эксперименте полностью исключены протечки. Есть щель для контакта геля с буфером: когда пользователь вставляет стекла с гелем внутрь столика, эта щель надежно перекрыта «подушечкой», которая находится сзади нее, и поэтому протечки просто не может быть. После того, как система закрыта, ее можно поставить под углом 45 градусов, после чего она сохраняет устойчивость, и заполнять сначала разделяющим гелем до линии, а потом наслоить концентрический гель, вставить гребенку с определенным количеством кармашков и дождаться полимеризации. Гель при заливке идет самотеком, наслаивается и не проливается, что очень удобно. Кроме того, стекла достаточно толстые, и не нужно сливать агарозную пробку: есть отверстие, через которое гель сам «производит» пробку, потому что отверстие прижимается к специальным резиночкам.
Потом устройство следует открыть, достать гель и перенести в камеру. Этот процесс занимает время, требует определенных навыков и подготовки, но его можно реализовать самостоятельно.
Но можно пойти по более легкому пути и воспользоваться готовым гелем – например, 10%-ным Bis-Tris.
ThermoFS предлагает гели под различные процессы – их можно подобрать на сайте. Например, есть очень интересные гели с коническими лунками – чтобы проба вся туда стекала, а также с лунками deep-well, в которые входят 60 мкл пробы. Каждый гель поставляется в индивидуальной упаковке, с небольшим количеством буфера, предотвращающим пересыхание геля. Упаковку нужно вскрыть, стряхнуть лишний буфер, удалить гребенку, а также удалить полоску, которой заклеена щель для контакта геля с буфером – если этого не сделать, гель-электрофорез не пойдет. Затем пластину с гелем вставляют внутрь камеры и поджимают.
Система готова к нанесению образца. Его добавляют в соответствующие лунки и запускают гель-электрофорез. Устанавливаем напряжение 200 вольт. Этот параметр и использование буфера MES SDS сокращает время фореза: полное разделение произойдет за 20 минут.
Буферы Novex – часть портфолио ThermoFS для проведения электрофореза.
На сайте компании есть информация о многочисленных продуктах с возможностью их подбора. Доступна информация по выбору гелей, буферов и других компонентов и на флеш-носителях. Условия эксперимента пользователь подбирает в зависимости от белков, которыми он располагает, индивидуально. Буферы, белки, мембраны, концентрация геля могут быть разными, и к ним у ThermoFS есть таблица рекомендаций по подбору компонентов.
Отметим, что на пластике нанесены картинки самих лунок – это позволяет практически вслепую работать дозатором и не промахнуться при заполнении камеры буфера, поскольку при этом не видно границы полиакриламидного геля.
После добавления образца на систему надевается крышка и ее подключают к источнику тока: плюс к плюсу, минус к минусу, а затем выбирают нужный протокол – он занесен для каждого геля.
Вообще для электрофореза есть несколько видов камер. Маленькая рассчитана на один гель, в нее входит всего 40 мл буфера.
Есть побольше – у нее отсеки находятся бок о бок, есть белая подложка, позволяющая пользователю видеть, как наносятся пробы, как разгоняются эти пробы и маркёр. Два отсека разделены перемычкой и не связаны. Можно проводить электрофорез только в одном отсеке, тогда буфера нужно взять вдвое меньше. Отсеки находятся бок о бок: пользователю не нужно потом камеру переворачивать, а у некоторых производителей отсеки находятся один за другим, это вынуждает переворачивать камеру. Но чем меньше манипуляций и движений производится с камерой, тем лучше идет форез.
Электроды находятся далеко друг от друга, и это позволяет не ставить камеру в лед или охлаждать иным способом: весь процесс проводится на рабочем столе.
Полная версия статьи доступна на нашем сайте