Оригинальная статья для журнала: Les nouvelles esthetiques 2/2022
Автор статьи:
Владимир ХАБАРОВ, кандидат химических наук, директор АНО «Научно-исследовательский центр гиалуроновой кислоты»
Появление в середине прошлого века новой области естествознания – молекулярной биологии позволило понять одно из важнейших свойств полимеров биологического происхождения – белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов. Эти гигантские макромолекулы служат носителями информации, определяющей характерные, во многом основополагающие свойства тех или иных живых организмов. Достижения молекулярной биологии дали толчок к формированию молекулярной биофизики, молекулярной медицины и, наконец, пришло время говорить о становлении молекулярной косметологии.
Красота и здоровье кожи зависит главным образом от метаболизма трёх основных биополимерных молекул – гиалуроновой кислоты, коллагена и эластина. Полисахаридная молекула – гиалуроновая кислота испытывает наиболее быстрый обмен (турновер) и подвержена более частым структурным нарушениям в первой половине возрастных изменений организма.
Коллаген более стабильная белковая молекула и в силу этого вовлекается во многие нерегулируемые химические трансформации, кардинально меняющие его свойства. Коллаген требует коррекции во второй половине жизни.
Эластин в основном синтезируется эмбриональными фибробластами, и далее содержание его в дерме постоянно уменьшается с возрастом.
Совершенно очевидно, что для коррекции возрастных изменений кожи на каждом этапе требуются свои технологии активации биохимических циклов с участием этих главных макромолекул, – этим и призвана заниматься молекулярная косметология. С другой стороны, молекулярная косметология формируется как часть доказательной медицины, опираясь на самые современные методы анализа, такие как: молекулярная иммунофлуоресцентная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, фингерпринтинг пептидов (PLF), жидкостная хроматография с обращенной фазой в сочетании с тандемной масс-спектроскопией (ЖХ-МС/МС), которая используется для определения протеомного профиля биологических гидрогелей. К этому стоит добавить различные методы исследования биомаркеров старения в рамках так называемого «мультимаркерного подхода».
Мультимаркерный подход и нейроэндокринные биомаркеры старения кожи
Старение кожи обусловлено целым рядом инволюционных процессов, в том числе снижением скорости деления кератиноцитов, накоплением измененных фибробластов с фенотипом старения (сенесцентных фибробластов) и значительным уменьшением скорости синтеза коллагеновых и эластиновых белков дермы. Сопровождающая старение деградация кожных покровов, обусловлена сразу несколькими факторами: старением клеток, нарушением регуляции апаптоза, уменьшением запасов мезенхимальных стволовых клеток с нарушением их дифференцировки, что означает снижение регенеративной способности дермы. При этом страдает и микроциркуляция, что связано как с уменьшением числа и размеров сосудов дермального слоя кожи, так и с нарушением тонуса стенок сосудов. Охарактеризовать возрастные изменения процессов клеточного и тканевого гомеостаза с помощью молекулярных белковых биомаркеров старения – задача чрезвычайно важная и актуальная, и что самое главное – выполнимая. Успешная реализация концепции бимаркеров старения явилась бы огромным шагом на пути понимания основных молекулярных клеточных процессов, протекающих при старении, и позволила бы проводить скрининг потенциальных препаратов для анти-возрастной медицины. В настоящее время развиваются подходы, в которых предлагается использовать совокупность нескольких десятков белковых биомаркеров, относящихся к различным функциональным группам: биомаркеры стресса эндоплазматического ретикулума, окислительного стресса, эпигенетических изменений, геномной стабильности, дегенерации тканей. За последние 15-20 лет развитие методов иммуногистохимии позволило вывести на новый уровень поиск и валидацию новых биохимических, молекулярно-генетических биомаркеров старения человека. При интерпретации молекулярно-биологических данных необходимо опираться на пул различных биомаркеров. То есть измеряемых параметров должно быть много – и чем их больше, тем более объективную оценку влияния тех или иных препаратов на протекание процессов старения можно получить. Ниже приводится перечень наиболее перспективных кандидатов на роль биомаркеров старения кожи, основанный на собственных экспериментальных результатах [1-9] и на анализе современной научной литературы по данному направлению [10-24].
Периостин (Periostin)
Белок периостин секретируется клетками эпидермиса во внеклеточный матрикс, где является важным участником процесса формирования коллагена. Он также служит лигандом для ряда рецепторных белков-интегринов. С возрастом его активность падает. Этот белок синтезируется в фибробластах, он является главным регулятором синтеза фибрилл коллагена правильного диаметра и определяет их конформацию. Активность периостина с возрастом падает, что не влияет на общее количество производимого коллагена, но приводит к появлению фибрилл большего диаметра и других аберрантных структур. В результате такой коллаген быстрее деградирует под действием металлопротеиназ, главной из которых выступает MMP-1.
Белок Клото
Белок Клото – это трансмембранный белок, присутствие которого замедляет старение организма. Внутри клетки белок Клото подавляет активность гена WNT – одного из главных генов-триггеров процесса саморазрушения и истощения стволовых клеток, что напрямую связано со старением тканей. С возрастом в организме отмечается недостаток белка Клото, что фенотипически проявляется, в частности, атрофией кожи.
C-myc
Транскрипционный фактор C-myc влияет на структуру хроматина и регулирует экспрессию большого количества генов человека. Этот белок может делать клетку чувствительной к сигналам апаптоза, но и приводить к клеточному старению. При старении активность белка C-myc значительно снижается, что делает его важным маркером старения.
GDF11
Фактор дифференцировки роста GDF11 по структуре и функциям близок белку миостатину. Главной ролью циркулирующего в крови GDF11 является индукция синтеза коллагена I и III типа, а также участие в регуляции синтеза гиалуронана. При старении его секреция фибробластами уменьшается.
GDF15
При нормальных условиях фактор дифференцировки роста GDF15 экспрессируется на базовом уровне в большинстве тканей и органов. Его функции пока до конца не вяснены. Активность этого белка существенно выше у фибробластов стареющей кожи. Его часто ассоциируют с развитием процесса старения, в первую очередь, кожных покровов.
KIFC3
Утилизация в аппарате Гольджи дефектных белков является важнейшим процессом по поддержанию гомеостаза клеток. Белок KIFC3 по структуре близок белку кинезину и участвует в транспорте неправильных белков в лизосомы. С возрастом его уровень падает, что сказывается на активности фибробластов стареющей кожи.
CCN1(CYR61)
Секретируемый миофибробластами во внеклеточный матрикс белок CCN1 контактирует с рецепторами, интегринами и протеоглюканами. С возрастом его уровень повышается, что приводит к избыточной активности белка р21, замедлению регенеративной способности дермы и старению кожи. Белок CCN1 является важнейшим негативным регулятором синтеза коллагена первого и третьего типа. Фибробласты дермы с возрастом продуцируют всё возрастающее количество белка CCN1, что приводит к нарушениям в формировании и функционировании межк леточного матрикса.
Кроме подавления синтеза коллагена за счёт ингибирования генов рецептора TβRII, CCN1 индуцирует синтез ряда металлопротеиназ (MMP-1, MMP-3, MMP-10 и MMP-23), непосредственно ответственных за деградацию фибрилл коллагена в межклеточном матриксе. Наконец, CCN1 стимулирует активность цитокинов IL-1β, IL-6 и IL-8, что приводит к воспалительным процессам в дерме.
EF-1a
Белок EF-1a отвечает за скорость синтеза белков и пептидов, его относят к экспрессионным биомаркерам. Экспрессия генов осуществляется в процессе транскрипции, созревания первичной РНК и трансляции. Трансляция – это синтез белка на матрице РНК с помощью рибосомы, которая представляет собой сложный комплекс белков и РНК. Одним из таких белков и является фактор элонгации (этап биосинтеза белка) трансляции EF-1a. При старении у человека уровень экспрессии этого белка повышается, что также является биомаркером старения.
Прохибити́н (Prohibitin, PHB)
Прохибитин является многофункциональным митохондриальным белком, локализованным на внутренней мембране митохондрий. Он регулирует синтез митохондриальной ДНК, отвечает за стабильность организации и количестве копий митохондриальной ДНК, и играет важную роль в регуляции дыхательной активности митохондрий. Повреждения митохондриальной ДНК могут приводить к нарушению энергетического обеспечения клетки и накоплению различных высокоактивных молекул, оказывающих негативное воздействие на кожу, способствуя ее старению. Белок PНВ выступает в качестве рецептора в запуске митофагии, защищает клетки от окислительного стресса и связанных с ним воспалительных процессов. Метаболизм митохондрий приводит к образованию побочных продуктов, которые вызывают повреждение ДНК и мутации.
CAP1
Белок САР1 является ферментом, который контролирует проницаемость эпидермиса и абсолютно необходим для его восстановления. Активность этого белка с возрастом падает.
VEGF и VEGF-R
Белок VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и его рецептор VEGF-R относятся к сосудистым биомаркерам. Эти белки вполне могут соответствовать критерием биомаркеров старения, так как хронические нарушения микрокапиляров – один из признаков старения дермы. VEGF (Vascular endothelial growth factor) – это белок, стимулирующий васкулогенез (образование эмбриональной сосудистой системы) и ангиогенез (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе). Белки VEGF и VEGF-R служат частью системы, отвечающей за восстановление подачи кислорода к тканям в ситуации, когда циркуляция крови недостаточна. Основные функции этих белков – создание новых кровеносных сосудов в эмбриональном развитии или после травмы, обеспечение коллатерального кровообращения (создание новых сосудов при блокировании уже имеющихся).
ANXA6
Белок ANXA6 (аннексин 6) связывается с фосфолипидами клеточной мембраны и цитоплазмы. Механизм действия пока не выяснен, но увеличение с возрастом его уровня приводит к хронической повышенной активности про-воспалительного фактора NF-κB и тромбоспондина THBS1.
THBS1
Внеклеточный глюкопротеин тромбоспондин связывается с коллагеном типа V и VII, служит партнёром ламина, фибриногена и других белков в окружении фибробластов. С возрастом его активность возрастает.
Кальретикулин
Кальретикулин является маркером эндоплазматического ретикулума (ЭР). Это многофункциональный кальций-связывающий белок ЭР. Кроме регуляции внутриклеточной концентрации кальция, он вместе с кальнексином принимает участие в формировании третичной структуры белков, обладая функциями шаперона. Кальретикулин связывается с неправильно свернутыми белками и гликопротеинами и предотвращает их транспорт из ЭР к аппарату Гольджи. Снижение с возрастом содержания кальретикулина приводит к ухудшению контроля качества белка и деструктивным изменениям в процессе старения.
АР-1
АР-1 – транскрипционный фактор (транскрипционный комплекс, включающий белки c-fos- и c-jun-семейств), который является центральным индуктором нарушения гомеостаза коллагена в коже и представляет собой ключевое звено в патогенезе обоих типов старения. Фактор АР-1 регулирует экспрессию генов, кодирующих специфические ферменты – матриксдеградирующие металлопротеиназы ММР-1, ММР-3. АР-1 индуцирует повышение их экспрессии и, как следствие, стимулирует деградацию (фрагментацию) матриксных фибрилл коллагена дермы. Одновременно с этим активация АР-1 сопровождается снижением синтеза проколлагенов I и III типов (за счет блокировки эффектов трансформирующего фактора роста TGF-β, способствующего биосинтезу коллагена).
IL-8(CXCL8)
Обычно секретируемый при повреждениях клетками эпителия и эндотелия про-инфламаторный цитокин интерлейкин 8 (ИЛ-8) – является важным компонентом иммунной системы. В стареющей коже наблюдается всё более высокий его уровень, что способствует усилению окислительного стресса и нарушает гомеостаз фибробластов дермы.
CAPNS1
Белок CAPNS1 (кальпаин S1) принадлежит семейству цистеин-протеаз. Он служит регуляторной субъединицей кальций-зависимой тиол-протеиназы. Снижение его уровня с возрастом снижает способность фибробластов к росту и пролиферации.
CXCL1
Этот экспрессируемый макрофагами и эпителиальными клетками цитокин индуцирует активность нейтрофилов. Его активность существенно возрастает у фибробластов стареющей кожи.
Cystatin-S (CST4)
Цистатин-4 ингибирует некоторые цистеин-протеиназы и обнаруживается у человека в основном в слюне и слезах. Его уровень возрастает у фибробластов стареющей кожи.
MMP-1/3/13
Большинство металлопротеиназ (ММР) секретируется во внеклеточный матрикс в виде неактивных ферментов, и затем активируются рядом протеиназ. Активные MMP-3 деградируют коллаген типов II, III, IV, IX и X, а также фибронектин, ламинин и эластин. Кроме этого, ММР-3 способна переходить в ядро клетки, где участвует в активации генов ММР-1/7/13. Активность MMP1/3/13 существенно возрастает у фибробластов стареющей кожи, именно поэтому уровень внеклеточных металлопротеиназ может служить надежным маркером старения кожных покровов, относящимся к белковым бимаркером дегенерации тканей.
MMP-9
Эксперименты на животных свидетельствуют, что, действуя на различные субстраты, разные ферменты семейства ММР участвуют в регуляции таких физиологических процессов как морфогенез, резорбция и ремоделирование тканей, ангиогенез, миграция, белковая адгезия. Так, например, повышенная активность MMP-9 отмечена при ремоделировании ткани и её репарации, мобилизации матрикс-связанных факторов роста и процессинге цитокинов. Экспериментально доказанные результаты роста активности протеиназ, в частности ММР-9, в коже подвергнутой хроно- и УФ- старению, связано с утилизацией повреждений желатинизированного коллагена, и способствуют качественному ремоделированию межклеточного матрикса дермы.
SIRT1
По влиянию на протекание процессов старения наиболее изученным представителем семейства сиртуинов является белок SIRT1. Установлена способность SIRT1 активировать АТФ-регулируемую киназу AMPK – одного из важнейших регуляторов клеточного метаболизма. В стареющих клетках экспрессия SIRT1 снижается, что позволяет использовать его в качестве эпигенетического маркера старения.
SIRT6
Деацетилаза SIRT6 – один из важнейших факторов, необходимых для поддержания клеточного гомеостаза. В частности, она ингибирует главный про-инфламаторный фактор NF-kB. SIRT6 является также единственным сиртуином, для которого экспериментально доказана способность увеличивать жизнь у млекопитающих (на 15% у мышей). С возрастом активность его падает. SIRT6 - критический регулятор транскрипции стабильности генома, теломерной целостности, репарации ДНК и метаболического гомеостаза. Истощение пула SIRT6 приводит к аномальной структуре теломер и потере концевых последовательностей при репликации ДНК, в результате чего наблюдается нестабильность генома и преждевременное клеточное старение.
Р53
Установлено, что активация р53 происходит, в частности, в результате нарушений клеточной адгезии и фокальных контактов в системе «межклеточный матрикс» – «клетка». Действуя сразу по нескольким механизмам, р53 осуществляет как быструю реакцию на сильные стрессы, так и регулирует программу апоптоза поврежденных клеток. Это предотвращает накопление мутаций в клеточной популяции и обеспечивает генетическую стабильность.
TGF-β
TGF-β (Transforming growth factor-β). Свою функцию семейство этих белков осуществляет посредством взаимодействия со своими рецепторами на поверхности фибробластов – TβRI и TβRII, что инициирует каскады внутриклеточных реакций, контролирующих процессы синтеза коллагена.
p16INK4
Белок репликативного старения – p16INK4a является одним из биомаркеров старения и играет ключевую роль в процессах клеточного цикла. Большинство стареющих клеток вырабатывают p16INK4a , который обычно не экспрессируется в покоящихся или окончательно дифференцированных клетках. Повышенный уровень Р16, инициируемый окислительным стрессом или повреждением ДНК, способствует старению клеток и снижению способности их к самообновлению. Удаление этого белка снижает фенотипические изменения, связанные с возрастом. Данный белок является крайне важной терапевтической мишенью в области геронтологии. В настоящее время ученые находят все новые механизмы влияния p16INK4a на клеточный цикл и старение.
Каталаза, супероксиддисмутаза
К белковым маркерам старения, связанным с окислительным стрессом, который напрямую связан со свободно-радикальной теорией старения, относят ферменты супероксиддисмутазу (SОD) и каталазу. SOD – антиоксидантный фермент, который нейтрализует супероксид ион-радикал, относящийся к активным радикальным формам кислорода (АФК). SOD не без оснований считается антивозрастным белком, т.к. он снижает уровень оксидативного стресса. С возрастом его экспрессия заметно снижается. Каталаза признана наиболее важным антиоксидантным ферментом, участвующим в старении кожи человека. Продемонстрировано, что ультрафиолетовое излучение снижает активность и экспрессию каталазы в коже человека in vivo. Снижение экспрессии каталазы может вызвать накопление АФК. Каталаза достаточно интенсивно экспрессируется в коже, особенно в роговом слое. В процессе старения активность этого фермента изменяется с увеличением разрыва между дермой и эпидермисом. Таким образом, активность каталазы снижается в дерме и увеличивается в эпидермисе стареющей кожи.
Декорин
Белок декорин является компонентом соединительной ткани, он связывается с фибриллами коллагена I типа и играет определенную роль в сборке матрикса. Участвует в системе регуляции процессов восстановления на клеточном уровне кожных тканей. Декорин влияет на фибриллогенез, а также взаимодействует с фибронектином, тромбоспондином, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и трансформирующим фактором роста-бета (TGF-β). Было показано, что он регулирует активность TGF-β1. В процессе сборки межклеточного матрикса дермы декорин прикрепляется к фибриллам, обеспечивая формирование тонких, однородных волокон. При уменьшении с возрастом концентрации этого белка в коже появляется большое количество неоднородных волокон, что приводит к значительному снижению качества коллагенового каркаса. Декорин кроме того, участвует в регуляции клеточного цикла, аутофагии, активности эндотелиальных клеток, а также ингибирует ангиогенез. Этот процесс опосредуется высокоаффинным взаимодействием с VEGF-R (рецептором васкулоэндотелиального фактора роста). Декорин ингибирует и другие ангиогенные факторы роста – ангиопоэтин, фактор роста гепатоцитов (HGF) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF).
Аквапорин-3 (AQP3)
Одним из перспективных биомаркеров старения кожи является аквапорин-3 (AQP3). Аквапорины представляют собой группу белков, которые обеспечивают трансмембранный транспорт воды. К настоящему времени у человека описано 13 видов аквапоринов (AQP0-AQP12), которые экспрессируются в различных органах и тканях. AQP3 является самым распространённым аквапорином кожи, обеспечивая транспорт воды и глицерина, он играет, таким образом, важнейшую роль в гидратации кожи. AQP3 крайне значим для предотвращения потерь влаги через кожу и поддержания её эластичности. Кроме того, AQP3 необходим для дифференцировки и пролиферации кератиноцитов. Показано, что AQP3 экспрессируется во всех слоях эпидермиса, при этом максимальная его экспрессия характерна для наиболее гидратированного базального слоя. Следует отметить, что в настоящее время доказано, что AQP3 экспрессируется даже в роговом слое эпидермиса. Гидратация кожи обеспечивается AQP3 не столько за счет регуляции транспорта воды, сколько за счет транспорта глицерина. Данные экспериментальных исследований на мышиных моделях, убедительно показывают, что снижение экспрессии AQP3 может быть одним из важнейших механизмов развития различных вариантов старения кожи. Это открывает широкие возможности для использования экспрессии данного белка в качестве одного из маркеров инволюционных изменений кожи. Крайне перспективным также является определение вклада генетических полиморфизмов генов AQP3 в развитие преждевременного старения кожных покровов. Кроме того, увеличение экспрессии AQP3 может стать одним из перспективных подходов к лечению инволюционных изменений кожи лица.
Факторы, лежащие в основе формирования молекулярной косметологии
Любая наука начинается с накопления фактов, их осмысления и систематизации. Можно сказать, что молекулярная косметология стартовала на этом пути. Выделим основные моменты, которые позволяют сделать подобный вывод.
· Изучен целый ряд белковых маркеров, напрямую или косвенно ответственных за качество и архитектуру межклеточного матрикса кожи: проколлаген-1; коллаген I и III типа; эластин; матриксные металлопротеиназы (ММР); сшивающий фермента LOXL; TGF-β; периостин; декорин. В диапазоне от 2 до 8 раз был определен рост концентрации этих маркеров в исследуемых образцах кожи в результате воздействия гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты, сочетающих в своем составе цинк и кремний [2,3,5,8,9]. Особая важность коллагена и эластина для обеспечения структурной целостности внеклеточного матрикса кожи обусловлена их способностью к формированию отдельных или объединенных фибрилл, волокон и сеток в результате действия сшивающего фермента – лизилоксидазы (LOXL), уровень которого катастрофически падает с возрастом
· При применении препаратов гиалуроновой кислоты с микроэлементами был зафиксирован значительный, а в ряде случаев более чем 10-кратный рост, экспрессии генов, кодирующих белки, ответственные за процесс кожного старения. Уровень белков: p16INK4a , CCN-1, GDF-15, АР-1, которые являются ключевыми звеньями в патогенезе фото- и хроностарения, удалось снизить в 3-20 раз! Причем эффект сохранялся у пациентов разных возрастных групп, даже спустя 60 дней после окончания курса биоревитализирующих процедур [5,7,8,9]. На этом фоне наблюдали рост количества белков ассоциированных с молодой кожей в 2-12 раз (их часто называют «белками молодости»): SIRT1, SIRT6 (важнейшие регуляторы клеточного метаболизма, необходимые для поддержания клеточного гомеостаза); белка Клото (уменьшает клеточное старение в первичных фибробластах человека); прохибитина (участвует в запуске митофагии, которая несет главную ответственность за устранение поврежденных или лишних митохондрий); каталаза и супероксиддисмутаза (защищает клетки от окислительного стресса); белок р53 (осуществляет как быструю реакцию на сильные стрессы, так и регулирует программу апоптоза поврежденных клеток). Это очень важные экспериментально подтвержденные факты, свидетельствующие о глобальной роли кремния, цинка, фосфора в торможении процессов старения кожи. Есть все основания утверждать, что анти-возрастная терапия препаратами «Скинопро», «Тетраскил», «Кремнивайз» даст омолаживающий эффект в средне- и долгосрочной перспективе.
· Важное, если не сказать определяющее значение для достижения заявленного косметологического эффекта имеют особенности производственного процесса изготовления препаратов на основе гидрогелей гиалуроновой кислоты с микроэлементами. Технологические новации, подтвержденные патентами РФ, позволили создать хелатные комплексы микроэлементов с фрагментами гиалуроновой кислоты определенной молекулярной массы [25], а синтезированные биокомплексы гиалуронана с кверцетином и ресвератролом [26,27] открывают новый, эффективный путь доставки биоактивных соединений к клеточным структурам кожи. Это оказалось определяющим обстоятельством в достижении уникальных медико-биологических результатов в области превентивной анти-возрастной медицины.
· Гиалуроновая кислота связывает значительные количества воды и образует ячеистые гелеобразные структуры в водном растворе. По своей химической природе гиалуроновая кислота является анионным полимером и может эффективно взаимодействовать с положительно заряженными ионами металлов, приводя к возникновению гетерогенных макромолекулярных структур, влияющих на реологию гидрогелей. Причем даже микромолярные концентрации ионов некоторых металлов (цинка, кремния, марганца) существенно влияют на вязкостные характеристики гидрогелей гиалуронана. Расположенная внутри внеклеточного матрикса клетка при инъекционном введении плотного геля от воздействия сдвиговых напряжений получает сигналы механического сжимающего действия от соседних клеток. Такие механические сигналы на поверхности раздела клетка-матрикс приводят к так называемому механосенсорному стрессу, который определяет экспрессию генов, кодирующих те или иные белки межклеточного матрикса дермы. Процессы преобразования механических напряжений в биологические сигналы, участвующие в клеточном отклике на введение микроимплантата, есть суть явления - механотрансдукции. Преобразование механических напряжений в дискретные сигналы передается на внутренний цитоскелет клетки, а затем меняет биохимическую активность клеточных органелл. Это, активно развиваемое в последние 3-5 лет, направление в молекулярной биологии позволит с новых позиций объяснить многие эффекты в контурной пластике.
Результаты иммуногистохимического исследования препаратов Скинопро актив, Тетраскил нормал и Тетраскил форте
В работах [8,9] были проведены данные исследований совместного влияния хелатных комплексов кремния и цинка в инъекционных препаратах на основе гиалуроновой кислоты «СКИНОПРО АКТИВ», а также «ТЕТРАСКИЛ НОРМАЛ и ФОРТЕ» с активным фосфором, обеспечивающим регуляцию метаболических клеточных процессов в дерме у пациентов различных возрастных групп. Представлены результаты имуногистохимических исследований образцов кожи после блефаропластики верхних и нижних век пациентов в возрасте 41 год и 64 лет. Для исследования использовали следующие первичные моноклональные антитела к белкам: ММР 9 и 13, CCN-1, GDF-15.
Матриксные металлопротеиназы ММР-9, ММР-13
Межклеточный матрикс состоит из большого количества компонентов, которые обусловливают жесткость, подвижность и упругость кожи. Ремоделирование дермы осуществляется не только в результате активного физиологического функционирования, но и в процессе синтеза/распада (обновления, турновера) всех структурных компонентов. Процессы деградации структур межклеточного матрикса являются важной составной частью физиологического ремоделирования ткани. Коллагеновые белки постоянно повреждаются свободными радикалами, реакциями неферментативного гликирования (присоединения остатков глюкозы к амнокислотным остаткам белков), карбамилирования, билирубинирования, протеолиза. Эти изменения приводят к нарушению взаимодействия и ориентации макромолекул. Функции ММР не ограничиваются только ремоделированием межклеточного матрикса путем его разрушения, как это предполагалось до недавнего времени. Эксперименты на животных свидетельствуют, что, действуя на различные субстраты, разные ферменты семейства ММР участвуют в регуляции таких физиологических процессов как морфогенез, резорбция и ремоделирование тканей, ангиогенез, миграция, белковая адгезия. Так, например, повышенная активность MMP-9 отмечена при ремоделировании ткани и её репарации, мобилизации матрикс-связанных факторов роста и процессинге цитокинов. Экспериментально доказан рост активности протеиназ, в частности ММР-9, в коже подвергнутой хроно- и УФ- старению. Это связано с утилизацией повреждений желатинизированного коллагена, и способствует качественному ремоделированию межклеточного матрикса дермы. Активность MMР13 существенно возрастает у фибробластов стареющей кожи, именно поэтому уровень этого фермента может служить белковым бимаркером дегенерации тканей.
Результаты настоящего исследования маркера ММР-9 показывают (рис.1), что репаративные процессы в молодой коже (41 г) протекают более интенсивно, не только в сравнении уровня экспрессии, но и продолжительности пост-эффекта. Считается, что уровень некоторых внеклеточных металлопротеиназ ММР может служить мерой старения ткани. На сегодняшний день известно около 30 протеолитических ферментов, из которых ММР-1,3,13 разрушают большинство коллагеновых белков типа I, II, III, IV, IX, X. С возрастом продукция коллагена значительно снижается, а уровень его деградации растет, что не в последнюю очередь связано с ростом экспрессии гена, кодирующего ММР-13.
Экспериментально зафиксировано снижение в 2,5 раза количества ММР-13 в образцах кожи пациента 64 лет, и 3-х кратное падение ММР-13 в коже пациента 41 года после введения «Тетраскил нормал» (рис. 2). При этом наблюдается обратная картина – рост в 3,3 раза ММР-9 в биоптате кожи (41 год) и увеличение только в 1,5 раза у возрастной кожи (рис.1).
По многочисленным литературным данным к биомаркерам старения относят белки CCN-1, GDF-15 (growth differentiation factor 15). На рис. 3-4 приведены результаты исследований по влиянию препаратов «Скинопро актив», «Тетраскил нормал» и «Тетраскил форте» на экспрессию маркеров CCN-1, GDF-15 в коже пациентов различных возрастных категорий. Белок CCN1 (CYR61; cysteine-rich protein 61), присутствующий и внутри клеток, и во внеклеточном матриксе, начинает усиленно синтезироваться при заживлении ран. Установлено, что этот белок приводит к более быстрому старению фибробластов путем связывания интегрина-альфа-6-бета-1 и гепаран-сульфат-протеогликанов. CCN1 стимулирует активность цитокинов IL-1β, IL-6 и IL-8, что приводит к разрастанию воспалительных процессов в дерме. Таким образом, старение фибробластов – это процесс, зависимый от CCN-1. Во время заживления ран фибробласты сначала активно вырабатывают внеклеточный матрикс. Потом они начинают усиленно синтезировать CCN-1, что приводит к их собственной гибели и естественно к прекращению синтеза внеклеточного матрикса. При недостатке экспрессии CCN-1 в местах заживления ран отмечается удлинение жизни фибробластов и более выраженное образование ими элементов внеклеточного матрикса, Фибробласты на стадии старения не только сами прекращают производить коллаген, но и продуцируют белки, ускоряющие распад уже имеющегося коллагена и приводящие к деградации внеклеточного матрикса. Отвечает за это белок CCN1. Это подтверждается тем, что у мышей с мутированной, недействующей формой CCN1 фибробласты в области повреждения не переходили в фазу старения.
Падение уровня экспрессии белка CCN-1 для пациента старшей возрастной группы составляет 3-3,5 раза как для «Скинопро актив», так и в случае «Тетраскил нормал». Для пациента 41 года 20-ти кратное падение CCN-1 было зафиксировано для «Скинопро актив» и 5-ти кратное для «Тетраскил нормал». Это очень важный экспериментально зафиксированный результат, который свидетельствует о глобальной роли хелатных форм кремния, цинка и активного фосфора в торможении процессов старения кожи.
Белок GDF15 был впервые идентифицирован как ингибирующий макрофаги цитокин-1. В нормальных условиях белок GDF-15 присутствует в низкой концентрации в большинстве органов тела, но его количество резко увеличивается при воспалительных процессах в поврежденных тканях. Экспрессия белка GDF15 повышена в стареющих фибробластах кожи. В случае использования препарата «Тетраскил форте» наблюдали падение белка GDF-15 в 3 раза у возрастного пациента, и в 4 раза у средней возрастной группы (41г) (рис.5).
В одном из последних исследований была установлена связь белка GDF-15 с меланогенезом: чтобы исследовать этот процесс, человеческие меланоциты культивировали совместно с фибробластами, продуцирующими GDF15. Было обнаружено[28], что GDF15 стимулирует меланогенез в меланоцитах посредством активации MITF-тирозиназы через сигнальный путь β-катенина. Стимулирующее действие GDF15 на пигментацию было дополнительно подтверждено на коже, культивируемой ex vivo, и на реконструированном образце кожи человека. Эти результаты указывает на то, что GDF15, секретируемый стареющими фибробластами, может быть причиной старческой пигментации кожи [28]. В связи с этим можно ожидать, что препарат «Тетраскил форте» будет эффективен в борьбе с гиперпигментацией.
Это важные результаты свидетельствуют об усилении процессов, тормозящих старение кожи, при одновременном регулировании гомеостаза межклеточного матрикса дермы. Очевидно, что достаточно трудно выбрать какой-либо один биомаркер старения, который удовлетворял бы всем необходимым критериям научной оценки, так как каждый имеет как свои преимущества, так и свои ограничения. Поэтому поиск новых биомаркеров собственно старения, и маркеров, ассоциированных со старением процессов, – задача чрезвычайно актуальная для различных областей современной медицины и, особенно, для молекулярной косметологии как составной части антивозрастной медицины.
Рекомендуемая литература:
- Хабаров В.Н., Бойков1П.Я., Иванов П.Л., Московцев А.А. Перепрограммирование генома в адаптивных реакциях клетки. Влияние гиалуронанового гидрогеля с наночастицами золота на дифференцировку мезенхимных стволовых клеток в фибробласты.// Молекулярная медицина. 2019. Т.17. №1. С.32-36.
2. Хабаров В.Н., Жукова И.К., Кветной И.М. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ В ИНЪЕКЦИОННОЙ КОСМЕТОЛОГИИ ЦИНКСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ МЕТОДОМ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА.// Эстетическая медицина. 2019. Т.ХV111. №2. С.136-139.
3. Хабаров В.Н., Московцев А.А. Цинксодержащие препараты ГК. Перспективы применения в инъекционной косметологии.// Эстетическая медицина.2016.Т. ХV. №2. С.153-58.
4. Хабаров В.Н. Биоревитализация кожи комплексными препаратами ГК с низкомолекулярными биорегуляторами.// Эстетическая медицина. 2016. Т.ХV. №1. С.13-18.
5. Хабаров В.Н., Кветной И.М., Линькова Н.С., Пальцев М.А. Экспрессия маркеров клеточного обновления в клетках кожи человека под действием препаратов ГК.//Молекулярная медицина. 2020. Т.18. №5. С.53-57.
6. Хабаров В.Н., Кветной И.М., Линькова Н.С., Пальцев М.А. Препараты ГК регулируют экспрессию коллагена 1 типа и ММР-9 в коже человека. .//Молекулярная медицина. 2020.Т.18. №4. С.56-59.
7. Хабаров В.Н., Жукова И.К., Кветной И.М. Изучение физиолологической роли кремния и цинка в составе инъекционных гидрогелей ГК.// Эстетическая медицина. 2020. Т.Х1Х. №2. С.1-7.
8. Хабаров В.Н., Жукова И.К.,Иванов П.Л.,Кветной И.М. Физиологическая роль фосфора в организме человека. Взаимосвязь цинка и фосфора в регулировании метаболических клеточных процессов в дерме. Часть 1.// Эстетическая медицина. 2021. Т.ХХ. №4. С.1-8.
9. Хабаров В.Н., Жукова И.К., Кветной И.М. Препарат на основе гиалуроновой кислоты «Скинопро актив» с ионами цинка и кремния. Гистологические и иммуногистохимические исследования in vivo. Часть II. .// Эстетическая медицина. 2022. Т.ХХ1. №2. С.1-7.
10. Bollag W.B., Aitkens L., White J. et al. Aquaporin-3 in the epidermis: more than skin deep. Am J Physiol Cell Physiol. 2020;318(6):C1144-C1153.
11. Wang T, Nanda S, Papaefthymiou G, Yi D. Mechanophysical Cues in Extracellular Matrix Regulation of Cell Behavior. Chembiochem. 2020 May 4; 21(9):1254-64.
12. Wlaschek M, Maity P, Makrantonaki E, Scharffetter-Kochanek K. Connective Tissue and Fibroblast Senescence in Skin Aging. J. Investig. Dermatol. 2021; 141: 985-92.
13. Li C., Wang W. Molecular Biology of Aquaporins. Adv Exp Med Biol. 2017;969:1-34.
14. Li S., Li C., Wang W. Molecular aspects of aquaporins. Vitam Horm. 2020;113:129-181.
Mahanty S, Setty S. Epidermal Lamellar Body Biogenesis: Insight Into the Roles of Golgi and Lysosomes. Front Cell Dev Biol. 2021 Aug 12;9:701950.
15. Mancini M, Lena A, Saintigny G, Mahé C, Di Daniele N, Melino G, Candi E. MicroRNAs in human skin ageing. Ageing Res. Rev. 2014; 17: 9-15.
16. Basisty N, Kale A, Jeon O, Kuehnemann C, Payne T, Rao C, Holtz A, Shah S, Sharma V, Ferrucci L, Campisi J, Schilling B. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 2020;18(1):e3000599.
17. Baumann L, Bernstein E, Weiss A, Bates D, Humphrey S, Silberberg M, Daniels R. Clinical Relevance of Elastin in the Structure and Function of Skin. Aesthet Surg J Open Forum. 2021 May 14;3(3):ojab019.
18. Bian A, Neyra J.A, Zhan M, Hu M.C.(2015). Klotho, stem cells, and aging. Clin Interv Aging. 10:1233-43.
19. Bollag W.B., Aitkens L., White J. et al. Aquaporin-3 in the epidermis: more than skin deep. Am J Physiol Cell Physiol. 2020;318(6):C1144-C1153.
20. Borg M, Brincat S, Camilleri G, Schembri-Wismayer P, Brincat M, Calleja-Agius J. The role of cytokines in skin aging. Climacteric J. Int. Menopause Soc. 2013; 16: 514-21.
21. Tasselli L, Zheng W, Chua K. SIRT6: Novel Mechanisms and Links to Aging and Disease. Trends Endocrinol Metab. 2017;28(3):168-85.
22. Fonseca FL, da Costa Aguiar Alves B, Azzalis LA, Belardo TM. Matrix Metalloproteases as Biomarkers of Disease. Methods Mol Biol. 2017;1579:299
23. Gu Y, Han J, Jiang C, Zhang Y. Biomarkers, oxidative stress and autophagy in skin aging. Ageing Res Rev. 2020; 59:101036.
24. Фоменко А., Баранова А., Митницкий А., Жикривецкая С., Москалев А. Биомаркеры старения человека. 2016. СПб.: Европейский дом.
25. Иванов П.Л., Хабаров В.Н. Гидрогелевая водорастворимая композиция на основе гиалуроновой кислоты и ионов поливалентных металлов, и способ ее получения. Патент РФ №2710074, 2019.
26. Хабаров В.Н., Иванов П.Л. Биоактивная композиция на основе ГК, содержащей кверцетин, и способ ее получения. Патент РФ №2020121972.(2021).
27. Хабаров В.Н., Иванов П.Л. Биоактивная композиция на основе ГК, содержащей ресвератрол, и способ ее получения. Патент РФ №2020121968.(2021).
28. Kim Y, Kang B, Kim J, Park T, Kang H. Senescent Fibroblast-Derived GDF15 Induces Skin Pigmentation. J Invest Dermatol. 2020 Dec; 140(12):2478-86.e4.