Уильям Джеймс Дефо родился в маленьком городке Эпплтон в штате Висконсин. Он был седьмым из восьмерых детей. Его отец был хирургом, а мать медсестрой, они много работали и подолгу не бывали дома, так что мальчика практически вырастили пять старших сестер. По признанию актера, сестры постоянно рассказывали ему о сексе, так что к шести годам он уже узнал много интересного «о птичках и пчелках». Но когда попытался передать эти знания одноклассникам, они его побили, потому что сочли информацию отвратительной.
Уильяма назвали в честь его отца, но ему никогда не нравилось сокращение Билли, а Уильямом-младшим он быть не хотел. Коротким именем Уиллем его наградил школьный приятель, и когда Дефо стал актером, он оставил именно его, так как чувствовал себя с ним более естественно. Что касается фамилии, то по словам Уиллема, половина его родственников ставит в ней ударение на первый слог, а половина на второй — сам он выбрал последний вариант, потому что он звучал красивее и немного «по-европейски».
Дефо выгнали из школы за съемки «порнографического фильма». На самом деле это было недоразумение — для школьного проекта он решил снять ленту о своих соучениках-аутсайдерах и взял интервью у троих ребят: нудиста, сатаниста и парня, который выступал за легализацию марихуаны. В отснятом материале было довольно много рискованных моментов, которые Дефо собирался вырезать, но не успел — он ушел обедать, оставив пленки на монтажном столе, где их обнаружил один из учителей.
Разразился скандал, объяснения о том, что это «искусство», не помогли, и парня выгнали из школы. После этого он распрощался с родным городом и поступил в государственный университет Висконсина-Милуоки.
Дефо, по сути, не получил формального актерского образования. Он изучал драму в университете всего год, однако бросил его, чтобы присоединиться к труппе экспериментального «Театра Х» в Милуоки. Затем он переехал в театральную Мекку — Нью-Йорк. Там молодой актер поступил сначала в труппу авангардного театра The Performance Group, а затем вместе со своими коллегами Элизабет ЛеКомпт, Сполдингом Греем и другими основал собственный театр The Wooster Group, в котором проработал 27 лет, совмещая это с карьерой в кино.
В отношениях с театральным режиссером Элизабет ЛеКомпт Дефо прожил 27 лет. У них родился сын, однако они никогда не были женаты: по мнению Элизабет, брак означал, что женщина становится собственностью мужчины, а Уиллем уважал ее мнение.
Тем не менее, с годами он понял, что все-таки заинтересован в более традиционном союзе.
«Когда много путешествуешь», — сказал он в одном из интервью, «рано или поздно приходится принять решение о том, будешь ты моногамным или нет».
Со своей будущей женой, итальянской актрисой и режиссером Джадой Колагранде Дефо познакомился на улице в Риме в 2004 году и почти сразу сделал ей предложение. Он просто спросил ее за обедом: «Хочешь, завтра поженимся?» Они позвонили в мэрию и узнали, что если оставить заявку в тот же день, то на следующий действительно можно пожениться. Что Уиллем и Джада и сделали в присутствии своих лучших друзей — его менеджера и ее монтажера. После свадьбы Дефо получил второе гражданствои вместе с женой делит свою жизнь между Римом, Нью-Йорком и Лос-Анджелесом.