Оригинальное название статьи из источника:
"Многочисленные изменения во время подготовки образцов для ЭМ визуализации"
Общее описание процессов подготовки образца
Огромная проблема для вирусологов заключается в том, что они никак не могут утверждать, что то, что они представляют в качестве доказательства «вируса», имеет какое-либо отношение к природным частицам, которые встречаются in vivo, то есть внутри реального живого организма. Различные изменяющие клетки химические вещества/антибиотики и чужеродная РНК животных, которые смешиваются с исходным неочищенным образцом (мазок или BALF) от больного человека, немедленно опровергают любые заявления об очистке (утверждения о том, что используется образец без примесей, загрязняющих веществ, посторонних материалов). Тот факт, что к образцу добавляется так много всего, дисквалифицирует заявления об изоляции (отделении вируса от всего остального). Если процесса культивирования клеток (с добавленным к ним образцом, предположительно содержащим вирус) недостаточно, чтобы изменить образец за пределы его исходного состояния, разрушение естественной морфологии клеток, вызванное подготовкой образца для изображений с помощью просвечивающего электронного микроскопа, гарантирует, что произойдёт именно это. Ниже мы рассмотрим источники, описывающие некоторые этапы (фиксация и встраивание), через которые проходит уже измененный образец клеточной культуры при подготовке его к визуализации методом просвечивающей электронной микроскопии.
Первый источник: статья с названием "Подготовка клеток для оценки ультраструктурной локализации наночастиц методом просвечивающей электронной микроскопии" (Факультет химического машиностроения, Университет Кейс Вестерн Резерв, Кливленд, Огайо, США. Опубликовано 25 марта 2010 г.)
Цитата:
«Чтобы получить разрешение, необходимое для просмотра отдельных НЧ (наночастиц) (размер <100 нм), обычно проводится электронная микроскопия. Однако хрупкие биологические образцы, такие как культивируемые клетки, используемые в механистических исследованиях, требуют обезвоживания, окрашивания тяжелыми металлами и обеспечения прозрачности образца для электронов, чтобы образец выдерживал условия вакуума и генерировал соответствующий контрастный сигнал для формирования изображения . Дополнительные ограничения ПЭМ (просвечивающей электронной микроскопии) включают трудоемкую и токсичную подготовку образцов, трудности в различении низкоконтрастных наноразмерных материалов от особенностей клеточного фона (например, цитоплазматических гранул), получение двумерных черно-белых изображений и трудности в получении статистических выводов. В настоящее время стереологические принципы используются для количественной оценки пространственного распределения иммунозолота и других НЧ на основе их локализации в клетках и тканях для статистической оценки [25]. Эти
исследования основаны на анализе χ2 между группами лечения или внутри одной группы, чтобы определить различия в количестве поглощения или локализации в конкретных внутриклеточных компартментах. Целью этих исследований является возможность беспристрастного применения этих методов относительного количественного определения в ПЭМ ».
« Хотя альтернативные методы электронной микроскопии и спектроскопии постоянно разрабатываются для борьбы с артефактами
, возникающими во время обширной подготовки образцов (например, фиксация, дегидратация и окрашивание тяжелыми металлами), необходимой для высокого вакуума, визуализация энергии высоковольтного электронного луча тонких срезов в ПЭМ, нет истинных сравнительных методов . Таким образом, ПЭМ обычно используется многими группами для определения захвата и локализации НЧ внутри клеток, а также для получения сведений о механизме захвата, независимо от того, является ли он эндоцитарным [30–37] или нет [38] (рис. 1)». (ссылки из цитаты смотрите в источнике)
Конец цитаты.
Существует множество подготовительных процессов, используемых для подготовки образцов для визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии. К ним относятся фиксация, дегидратация, заливка, окрашивание тяжелыми металлами, изготовление срезов и т. д. Каждый из этих этапов изменяет исходный образец в той или иной форме или тем или иным способом. Все эти процессы способны создавать артефакты, которые можно принять за «вирусные» структуры. Хотя ученые пытаются смягчить эти эффекты с помощью новых технологий и методов, нет методов, которые могли бы заменить ПЭМ (просвечивающую электронную микроскопию).
В следующем источнике конкретно рассматривается фиксация и разбираются многочисленные проблемы, связанные с этим шагом.
Второй источник: Статья "Артефакты фиксации и как их минимизировать" в "Focal Plane" - специализированном сайт о микроскопии, поддерживаемый Journal of Cell Science (JCS) и охватывающий все области биологических наук, где они встречаются с микроскопией. Автор статьи: Хизер Браун-Хардинг, Заместитель директора лаборатории микроскопии,Кафедра биологии Университета Уэйк Форест, Уинстон-Салем, Северная Каролина, США
Артефакты фиксации и как их минимизировать
Цитата:
«Целью фиксации ваших клеток или тканей является сохранение образца как можно ближе к «живому состоянию»
Альдегиды
«Сшивающие агенты относятся к семейству альдегидов и обычно относятся к двум разным химическим веществам. Это формальдегид, который может быть в форме формалина или параформальдегида (PFA), и глутаровый альдегид (GA), бифункциональный альдегид. Оба химических вещества фиксируют образцы, сшивая белки через аминогруппы, эффективно стабилизируя структуру клетки.
Трудности, возникающие при использовании альдегидов, включают сохранение эпитопов, изменение клеточной структуры и плохую фиксацию мембран. Сшивание белков с помощью ГА вызовет изменения в структуре белка, потенциально изменяя эпитоп, на который вы нацелены с помощью антител . Вкратце, эпитоп — это специфическая часть молекулы, к которой прикрепляется антитело.
Органические растворители
Органические растворители фиксируют образцы с помощью метода дегидратации, который осаждает белки и экстрагирует липиды. Наиболее распространенными органическими растворами, используемыми для фиксации образцов, являются метанол, этанол и ацетон. Фиксация метанолом может быть выполнена охлаждённым метанолом всего за несколько минут с культивируемыми клетками и имеет дополнительное преимущество пермеабилизации клетки. Другое преимущество заключается в том, что спирты намного безопаснее использовать в лаборатории, чем альдегиды.
Недостатки использования органических растворителей заключаются в том, что они могут экстрагировать цитозольные или ядерные белки, а образец подвергается дегидратации и регидратации, что может разрушить органеллы и общую клеточную структуру . “
«В заключение следует сказать, что не существует идеального метода сохранения клетки, идентичной живому состоянию . Знание свойств фиксаторов и клеточных компонентов — отличный способ сузить круг условий для оптимизации вашего эксперимента. Быстро развиваются новые зонды и методы микроскопии. Мы можем обнаружить, что существующие методы недостаточны для новых технологий. Протоколы фиксации должны будут идти в ногу со временем, чтобы избежать создания артефактов, которые ранее не были заметны исследователям ».
Конец цитаты.
Как описано выше, цель фиксации состоит в том, чтобы сохранить образец как можно ближе к его «живому» состоянию. Однако после изъятия из естественной среды и воздействия многочисленных добавок и токсичных химикатов образец настолько далек от своего исходного состояния в организме, насколько это вообще возможно. Все, что касается процесса культивирования клеток, является искусственным, включая процессы, используемые для фиксации образца для визуализации. Эти шаги являются просто дальнейшими изменениями в уже подверженном различным манипуляциям образце.
Этот последний источник предлагает дополнительное понимание многочисленных проблем, связанных с этими процессами.
Третий источник: Статья "Вирусная инфекция при большом увеличении: методы 3D-электронной микроскопии для анализа архитектуры инфицированных клеток" , опубликованная на сайте https://www.mdpi.com/ . Авторы: Инес Ромеро-Брей ( Кафедра инфекционных болезней, молекулярной вирусологии, Гейдельбергский университет, Im Neuenheimer Feld 345, 69120 Гейдельберг, Германия) и ральф Бартеншлагер (Немецкий центр исследований инфекций, Гейдельбергский университет, 69120, Гейдельберг, Германия)
Вирусная инфекция при большом увеличении: методы 3D-электронной микроскопии для анализа архитектуры инфицированных клеток
Цитата:
1. Вирусология и электронная микроскопия (ЭМ)
«Исследования в области вирусологии идут рука об руку с развитием методов микроскопии. Среди них электронная микроскопия (ЭМ) сыграла важную роль из-за небольшого размера вирусных частиц, которые, за очень редкими исключениями, не могут быть визуализированы с помощью обычной световой микроскопии [ 1 , 2 , 3 , 4 ]. До изобретения электронного микроскопа в 1931 г. немецкими инженерами Эрнстом Руска и Максом Кноллем [ 5 ] вирусы выявлялись косвенно, например, посредством цитопатического действия, которое они вызывают в инфицированных клетках, или посредством клинических проявлений.. Однако наличие ЭМ позволило визуализировать и идентифицировать многих инфекционных агентов, вызывающих заболевания или живущих «в симбиозе» с другими организмами. Так, на протяжении 20 века ЭМ была стандартным методом диагностики вирусов (обзоры [ 6 , 7 , 8 , 9 ]). Поскольку они проще и быстрее, чаще используются методы молекулярной биологии, такие как ПЦР или ИФА с более высокой пропускной способностью. Тем не менее, ЭМ остается необходимым для идентификации, например, неизвестных появляющихся вирусов, для которых нет доступных праймеров, антител или зондов [ 10 ].Это связано с тем, что ЭМ является общим подходом и может обнаруживать все вирусные частицы («всеобъемлющие»), присутствующие в образце [ 11 , 12 ]».
2. Подготовка клеток для ЭМ
«Подготовка клеток к ЭМ должна преследовать одну главную цель — сохранить ультраструктуру в состоянии, максимально приближенном к снимку живого состояния . Цитируя Гарета Гриффитса, пионера в области ЭМ [ 14 ]: «структура клетки должна быть сохранена точно такой же, какой она была в живом состоянии , и должна быть визуализирована на пределе разрешения электронного микроскопа». Для достижения этой цели доступно несколько методов и установлены стандартные рецепты. Хотя они очень помогают в рутинных приложениях, их необходимо часто модифицировать при решении конкретных биологических вопросов».
«Стандартный метод подготовки клеток к обычной ЭМ включает следующие этапы: фиксация, встраивание и секционирование . Они будут подробно описаны ниже и обобщены на рисунке 1 ».
2.1. Фиксация клеток
Первым и наиболее важным шагом для визуализации биологических объектов с помощью ЭМ является фиксация, поскольку она определяет, насколько близко изображение, наблюдаемое в микроскоп, напоминает структуру в естественных условиях. Цель состоит в том, чтобы избежать или уменьшить артефакты, вызванные экстракцией, денатурацией, стерическими затруднениями, химическим изменением эпитопов (особенно важно для иммуноцитохимического анализа) и изменениями объема и формы (критично для методов трехмерного анализа, описанных в этом обзоре) [ 14 ]. Фиксация клеток может осуществляться двумя различными методами: химической фиксацией ( рис. 1 А) или криоиммобилизацией (т. е. физической фиксацией; рис. 1 Б).
2.1.1. Химическая фиксация
Химическую фиксацию клеток обычно проводят забуференными альдегидами. На этом этапе альдегиды создают меж- и внутримолекулярную сеть ковалентных взаимодействий («поперечных связей»), в основном между аминогруппами, которые стабилизируют биологический образец . Это приводит к образованию большой трехмерной сети необратимых поперечных связей по всей цитоплазме в течение от десятых долей секунды до минут.
Хотя у большинства лабораторий есть свои предпочтения, глутаровый альдегид (GA) отдельно или в сочетании с параформальдегидом (PFA) является наиболее часто используемым первичным фиксатором . Однако ГА индуцирует разветвленную сеть поперечных связей, которые стерически препятствуют доступу антител к антигену . По этой причине формальдегид, который меньше маскирует антигенность, в основном используется для иммуноцитохимических исследований, таких как иммунофлуоресценция [ 14 ].
На всех этапах обработки очень важно, чтобы клетки не высыхали. Это особенно важно перед фиксацией, до первого контакта с фиксатором, когда клетки еще живы. Хотя процесс фиксации убивает клетки, клетки должны умирать «правильно», чтобы гарантировать, насколько это возможно, что все клеточные компоненты сохраняются так хорошо, как когда они были живыми. . С этой целью можно принять во внимание ряд других факторов. Следовательно, чистота альдегидов также имеет решающее значение . Поэтому рекомендуется использовать альдегиды марки EM, поставляемые коммерческими поставщиками. Кроме того, на сшивающую способность этих альдегидов влияют время, концентрация и температура [ 19 ].]. Рутинную фиксацию проводят в течение 15–30 мин при комнатной температуре с использованием буфера с физиологическим рН (6,8–7,4) и концентрацией не менее 0,1 М (моль/л) [ 14 ]. Природа буфера также играет очень важную роль при фиксации: какодилат натрия, фосфат натрия, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота) и PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфокислота) кислота)) являются, например, одними из наиболее широко используемых».
« К сожалению, не существует общего рецепта химической фиксации. Наилучшие результаты требуют адаптации к индивидуальным экспериментальным условиям . Поэтому мы рекомендуем проконсультироваться со специалистом по ЭМ или ознакомиться с литературой, чтобы помочь вам выбрать оптимальные условия (включая тип и концентрацию альдегида, тип, концентрацию и pH буфера, время и температуру фиксации), адаптированные для ваших экспериментов.
После фиксации клетки промывают выбранным буфером , в котором клетки можно хранить при 4°C до дальнейшей обработки. Обратите внимание, что культивируемые клетки могут быть подготовлены для ЭМ в виде монослоев или гранул ( рис . 1А). При дальнейшей обработке клеток в виде гранул их необходимо соскребать с чашки для культивирования клеток после фиксации, если они не растут в суспензии. В качестве альтернативы для крио-ЭМ культивируемые клетки можно «обработать трипсином» перед фиксацией ( рис . 1В). Следует иметь в виду, что осаждение клеток изменяет их морфологию и может привести к артефактам ( рис. 2 )».
« Главный недостаток химической фиксации заключается в том, что она изменяет структуру клетки, образуя сеть сшитых молекул. Такая сеть подвержена артефактам , что является серьезной проблемой для большинства исследований, основанных на ЭМ (подробное обсуждение этой темы см. в [ 21 ]). Тем не менее, химическая фиксация десятилетиями была основой ЭМ, поскольку она достаточно хорошо сохраняет морфологию клеток ».
«Как уже указывал Смолл 34 года назад [ 24 ], большинство ультраструктурных изменений может происходить во время постфиксационной обработки образцов для заливки (описано ниже), а не во время фиксации . Таким образом, индивидуальный протокол должен быть разработан для максимальной сохранности интересующих клеток/тканей, включая как оптимальную фиксацию, так и условия после фиксации».
2.1.2. Криофиксация
Технологии замораживания представляют собой альтернативу химической фиксации, подверженной артефактам (рассмотрено в [ 25 ]). Основной принцип заключается в остановке клеток путем быстрого охлаждения, процесса, который занимает несколько миллисекунд, что приводит к одновременной стабилизации всех клеточных компонентов без изменения их среды. Самый простой метод заключается в погружении клеток, растущих на ЭМ-сетках, в жидкий этан или пропан с помощью погружения [ 26 , 27 ] и струйной заморозки [ 28 , 29 , 30 , 31 , 32 ] соответственно ( рис. 1 ).Б). Неотъемлемым ограничением этих подходов к быстрому охлаждению является то, что образцы могут быть застеклованы только на глубину микрометров от их поверхности [ 33 , 34 , 35 ]. Это связано с плохой теплопроводностью воды: высокие скорости поверхностного охлаждения быстро затухают внутри образца, достигая низкого значения, вызывающего кристаллизацию воды [ 36 , 37 , 38 ]. Кристаллы льда изменяют ультраструктуру цитоплазмы, вызывая расслоение фаз между водой и растворенными веществами [ 37 , 39 ]. Хуже того, рост кристаллов льда может привести к образованию отверстий в мембранах и разрушению органелл [ 40 ].
«Способ предотвращения образования льда заключается в предварительной инкубации биологических образцов с антифризами для снижения концентрации свободной воды, такими как сахароза, глицерин, ДМСО или различные полимеры. Однако использование этих криопротекторов вносит изменения в исходную цитоархитектонику [ 40 ]».
2.2.1. Встраивание химически фиксированных клеток
« После химической фиксации клетки необходимо дополнительно обработать, чтобы проанализировать их с помощью ЭМ . Из-за их низкой способности рассеивания электронов биологические образцы по своей природе малоконтрастны [ 56 ]. Поэтому тяжелые металлы, такие как четырехокись осмия (OsO 4 ) и ацетат уранила (UA), обладающие высоким сродством ко многим клеточным структурам, используются после фиксации в качестве контрастирующих агентов в рутинной ЭМ . Благодаря своей реакционной способности с ненасыщенными ацильными цепями мембранных липидов OsO 4 , например, способствует удержанию липидов [ 57 , 58 ], в дополнение к его роли в контрастирующих структурах (особенно мембранах). Точно так же Сильва и соавт. [ 59] показали, что МК играет роль в защите липидов от экстракции растворителем».
«Впоследствии клетки внедряются в смолы. Для традиционной пластиковой заливки требуются смолы с термоиндуцированной (выше 50 °C) полимеризацией, такие как эпоксидные смолы, которые часто используются с момента их первого появления в 1950-х годах [ 63 ]. Из-за их чрезвычайно гидрофобной природы клетки/ткани должны быть полностью обезвожены в серии восходящих растворителей, денатурирующих белки (например, этанол) перед инфильтрацией ( рис . 1А). В результате высокая степень ковалентного взаимодействия между эпоксидными смолами и биологическим материалом делает эти смолы малосовместимыми для иммуноцитохимии ».
2.4. Бессмоляная обработка клеток
«Как указывалось ранее, на сохранение ультраструктуры клеток влияет не только метод фиксации, но и последующие этапы обработки (дегидратация, инфильтрация и полимеризация смолы). Вследствие денатурирующих эффектов этих стадий обработки структуры редко сохраняются в той степени, в какой они появляются in vivo. Чтобы избежать этих процедур подготовки, подверженных артефактам, предпочтительным методом является замораживание или витрификация клеток (описано выше) с последующим их прямым исследованием при очень низких температурах с помощью крио-ЭМ. Однако опять же из-за ограниченной проникающей способности электронов только тонкая клеточная периферия замороженных клеток может быть визуализирована с помощью стандартной крио-ЭМ [ 79 ]».
«Несмотря на все эти достижения, основным недостатком ЭМ является ее неспособность изучать динамику биологических процессов . Как мы описали в этом обзоре, клетки должны быть зафиксированы, чтобы их можно было исследовать в вакуумной атмосфере электронного микроскопа».
Обратите внимание, что как фиксация, так и встраивание, как известно, изменяют морфологию клеток, вводят артефакты и редко сохраняют структуры такими, какими они были бы в естественных условиях. Помните, что эти шаги являются дальнейшим изменением исходного образца после высокотоксичного процесса культивирования клеток.
В итоге:
- Хрупкие биологические образцы, такие как культивируемые клетки, используемые в механических исследованиях, требуют обезвоживания, окрашивания тяжелыми металлами и прозрачности для электронов, чтобы образец выдерживал условия вакуума и генерировал соответствующий контрастный сигнал для формирования изображения.
- Ограничения ПЭM включают: Длительная и токсичная подготовка проб
Трудности в различении низкоконтрастных наноразмерных материалов от особенностей клеточного фона (например, цитоплазматических гранул)
Изготовление двухмерных черно-белых изображений
Трудно делать статистические выводы - Проводятся исследования того, как беспристрастно использовать методы количественного определения в ПЭМ .
- Альтернативные методы электронной микроскопии и спектроскопии постоянно разрабатываются для борьбы с артефактами, возникающими во время обширных этапов подготовки образцов, но нет настоящих сравнительных методов .
- Цель фиксации — сохранить образец как можно ближе к «живому состоянию».
- Фиксация с помощью альдегидов сопряжена с трудностями, связанными с:
Сохранением эпитопа
Изменением клеточной структуры
Плохой фиксации мембран
Изменения в структуре белка, потенциально изменяющего эпитоп, на который нацелены антитела.
- К недостаткам использования органических растворителей для фиксации относятся:
Они могут извлекать цитозольные или ядерные белки.
Образец подвергается обезвоживанию и регидратации, что может разрушить органеллы и общую клеточную структуру.
- Не существует идеального метода сохранения клетки, идентичной живому состоянию.
- Может оказаться, что существующие методы недостаточны для новых технологий.
- Протоколы фиксации должны будут идти в ногу со временем, чтобы избежать создания артефактов , которые ранее не были видны исследователям.
- До ПЭМ «вирусы» выявляли косвенно по цитопатическому эффекту в инфицированных клетках или по клиническим проявлениям.
- ЭМ считается необходимым методом для выявления неизвестных появляющихся «вирусов», для которых нет доступных праймеров, антител или зондов.
- Это связано с тем, что ЭМ является общим подходом и может обнаруживать все «вирусные» частицы, присутствующие в образце.
- Этапы подготовки к ПЭМ включают фиксацию, встраивание и разрезание.
- Целью фиксации является предотвращение или уменьшение артефактов, вызванных:
Экстакцией
Денатурацией
Стерическими помехами
Химическим изменением эпитопов
Изменением объема и формы
- Глутаральдегид (GA) отдельно или в сочетании с параформальдегидом (PFA) являются наиболее часто используемыми первичными фиксаторами.
- Процесс фиксации убивает клетки, а клетки должны умирать «правильно», чтобы гарантировать, насколько это возможно , что все клеточные компоненты сохраняются такими, какими они были, когда они были живыми.
- Чистота альдегидов имеет решающее значение, а способность этих альдегидов к сшиванию зависит от времени, концентрации и температуры.
- Общего рецепта химической фиксации не существует, и для достижения наилучших результатов требуется адаптация к индивидуальным экспериментальным условиям.
- После фиксации клетки промывают выбранным буфером.
- Осаждение клеток для фиксации изменяет их морфологию и может привести к артефактам.
- Главный недостаток химической фиксации заключается в том, что она изменяет структуру клетки, образуя сеть перекрестно-сшитых молекул, которая подвержена артефактам.
- В то время как в процессе фиксации происходят незначительные изменения, большинство ультраструктурных изменений происходит во время постфиксационной обработки образцов для заливки.
- Методы замораживания представляют собой альтернативу химической фиксации , подверженной артефактам .
- Однако кристаллы льда изменяют ультраструктуру цитоплазмы, вызывая расслоение фаз между водой и растворенными веществами.
- Хуже того, растущие кристаллы льда могут привести к образованию отверстий в мембранах и разрушению органелл.
- Продукты, используемые для предотвращения образования кристаллов льда, называемые криопротекторами, вносят изменения в исходную цитоархитектонику.
- После химической фиксации клетки необходимо дополнительно обработать, чтобы проанализировать их с помощью ЭМ.
- Тяжелые металлы, такие как тетроксид осмия и ацетат уранила, обладающие высоким сродством ко многим клеточным структурам, используются после фиксации в качестве контрастирующих агентов в рутинной ЭМ.
- После фиксации образцы заливают смолой.
- Из-за своей чрезвычайно гидрофобной природы клетки/ткани перед инфильтрацией должны быть полностью обезвожены в ряде растворителей, денатурирующих белки (например, этанол).
- В результате высокая степень ковалентного взаимодействия между эпоксидными смолами и биологическим материалом делает эти смолы малосовместимыми для иммуноцитохимии.
- На сохранение ультраструктуры клеток влияет не только метод фиксации, но и последующие этапы обработки (дегидратация, инфильтрация и полимеризация смолы).
- Вследствие денатурирующих эффектов этих подверженных артефактам этапов обработки структуры редко сохраняются в той степени, в какой они появляются in vivo (внутри живого организма).
- Основным недостатком ЭМ является невозможность изучения динамики биологических процессов.
Перед подготовкой образца для ЭМ-визуализации не предпринимаются попытки ни очистки, ни выделения. В образце могут присутствовать миллиарды одинаковых частиц. Вирусологи выбирают любые сильно измененные частицы, соответствующие шаблону или идее «вируса», который они хотят найти, а затем делятся ими в качестве доказательства существования указанного «вируса». Они не принимают во внимание, что эти частицы, скорее всего, не были частью исходного образца с самого начала, а также то, что они были созданы в процессе культивирования, фиксации и внедрения. Они принимают форму, функцию и патогенность, никогда не доказывая этого.
Вот почему очистка/выделение неизмененного образца непосредственно от больного пациента является единственным способом гарантировать, что то, что отображается, имеет какое-либо отношение к делу. Даже различных признанных изменений, вызванных культивированием клеток, а также процессом подготовки ЭМ, более чем достаточно, чтобы усомниться в достоверности каких-либо результатов. В итоговом образце нет ничего, что не было бы изменено в той или иной форме. Не может быть никаких оснований утверждать, что то, что изображено, когда-либо было в исходном образце, взятом у больного пациента до того, как оно было подвергнуто многочисленным методам разрушения клеток. Это гарантия того, что образец будет изменен по сравнению с его первоначальным состоянием посредством этих процессов подготовки.
https://vk.com/club117920577 - наш паблик ВК
https://t.me/medbezumie - наш Телеграмм-канал
zen.yandex.ru/id/5da399275eb26800b1d2b1c5 - наш канал на Яндекс-Дзен
https://www.bitchute.com/channel/Zf6XYViDMMCa/ - наш канал на Битшут
https://youtube.com/channel/UCvdxEDXU0Xm4-SMEEwGk1tg - наш Ютуб-канал
