Хотя текущие исследования сигнальных молекул на основе микроскопии дали представление о динамике активации Т-клеток, им часто мешает необходимость прикреплять метки или флуорофоры к интересующим белкам. Фаррелл и др. разработали метод, основанный на микроскопии сверхвысокого разрешения, под названием pPAINT, с помощью которого они визуализировали пространственно-временное распределение фосфотирозин-связывающих доменов SH2 различных сигнальных и адаптерных молекул в активированных Т-клетках на липидных бислоях. В дополнение к демонстрации того, что этот метод можно использовать для отслеживания рекрутирования множественных сигнальных молекул в кластеры рецепторов Т-клеток, авт. также измерили время жизни связывания меченых доменов SH2 для анализа динамики передачи сигналов. Этот подход может быть применен к другим доменам белок-белковых взаимодействий для исследования других процессов передачи сигналов рецепторами на плазматической мембране.
Методы сверхвысокого разрешения продвинули наше понимание сложных клеточных структур и процессов, но требуют прикрепления флуорофоров к мишеням с помощью меток или антител, которые могут быть громоздкими и приводить к недостаточной маркировке. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали метод визуализации наноразмерных мест связывания сигнальных белков, используя преимущества их нативных доменов взаимодействия. Здесь мы продемонстрировали, что pPAINT (накопление белковых точек в наноразмерной топографии) является новым методом микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM), и использовали его для исследования передачи сигналов Т-клеток путем визуализации домена гомологии 2 Src (SH2), который распространен в сигнальные молекулы. Когда белки, содержащие домен SH2, перемещаются на плазматическую мембрану, домены избирательно, временно и обратимо связываются с предпочтительными фосфорилированными остатками тирозина на рецепторах. Это временное связывание дает стохастические мигающие события, необходимые для SMLM, при наблюдении с помощью микроскопии полного внутреннего отражения и позволяет количественно определить коэффициенты связывания в интактных клетках. Мы использовали pPAINT для выявления сайтов связывания нескольких Т-клеточных рецепторов с проксимальными сигнальными молекулами, включая Zap70, PI3K, Grb2, Syk, Eat2 и SHP2, и показали, что зонды могут быть мультиплексированы. Мы показали, что время полужизни связывания тандемного домена SH2 PI3K коррелирует с размером кластера сайта связывания в иммунологических синапсах Т-клеток, но более длительное время жизни связывания было связано с меньшими кластерами для моновалентного домена SH2 Eat2. Эти результаты демонстрируют потенциал pPAINT для исследования опосредованных фосфотирозином сигнальных процессов на плазматической мембране.
#наука #технологии будущего #эксперементы #учёные #исследования