Коронавирус имеет роскошную сахарную оболочку (см. рис.1 «Компьютерное моделирование структуры коронавируса SARS-CoV-2»). «Это поразительно», по словам Ромми Амаро (Rommie Amaro), наблюдающего за компьютерным моделированием одного из спайковых белков, который локализируется на поверхности вируса. Он окутан молекулами сахара, известными как гликаны. По словам компьютерного биофизика Амаро, Университет Калифорния, Сан Диего, «когда мы рассматриваем вирус со всеми гликанами, он совершенно неузнаваем». Многие вирусы имеют гликаны, покрывающие внешние белки, маскируя их от иммунной системы человека, как «волк в овечьей шкуре».
Рис 1. Компьютерное моделирование структуры коронавируса
SARS-CoV-2
В прошлом году, лабораторная группа Амаро вместе с коллегами создала самое полное визуальное представление оболочки вируса, основанное на структурных и генетических данных, визуализированное атом за атомом с помощью суперкомпьтера. Ученый опубликовал смоделированное изображение в Твиттере (англ. яз. Twitter). В течение часа, один из ученых задал вопрос, «что это за виток, не покрытый оболочкой, высовывается с верхней поверхности вируса?», Амаро понятия не имел, что ответить. Спустя 10 минут структурный биолог Джейсон Маклеллан (Jason McLellan) рассказал, что непокрытый оболочкой виток – это рецептор, связывающий домен (RBD), одна из трех секций спайкового белка, который связывается с рецепторами клеток человека (см. рис.2 «Скрытый спайковый белок»).
На компьютерном изображении Амаро видно, как домен (RBD) поднялся на самый вверх облака гликанов, в то время как два гликана пытаются зафиксировать его на месте, как «подножка на велосипеде». Однако, когда Амаро попытался видоизменить гликаны на компьютерной модели, домен (RBD) разрушился. Затем команда ученых под руководством биолога Маклеллана находит новое решение того же эксперимента в лаборатории, в ходе которого в июне 2020 г. ученые сообщили о том, что видоизменение двух гликанов сократит возможность спайкового белка связываться с рецептором человеческой клетки. Эту роль подробно никто ранее не рассматривал в коронавирусах. Возможно, удаление других двух сахарных молекул сможет снизить заразность вируса, хотя у исследователей пока нет способа сделать это.
С момента начала пандемии COVID-19 ученые пытаются полностью разобраться, как SARS-CoV-2 поражает клетки. Разбирая процесс заражения, они надеются найти более эффективные способы его блокирования с помощью улучшенных методов лечения и создания вакцин, а также узнать, почему новейшие штаммы, такие как вариант Дельта, более заразны.
Результатом 19 месяцев работы, подкрепленным десятилетиями исследований коронавируса, является подробный отчет о том, как SARS-CoV-2 проникает в клетки человека (см. рис. 3 «Жизненный цикл пандемического коронавируса»). Ученые обнаружили ключевые способы приспособления, которые помогают вирусу захватить клетки человека с удивительной силой и затем скрыться внутри. Позже, как только вирус покидает клетки, SARS-CoV-2 начинает решающий этап процесса. Подготавливая свои частицы для заражения еще большего числа человеческих клеток. С помощью некоторых инструментов вирус распространяется настолько быстро, что уносит миллионы жизней. «Вот почему его так сложно контролировать», - говорит вирусолог Вэнди Барклай (Wendy Barclay), Имперский колледж Лондона (Imperial college London).
Колючий и готовый
Все начинается с шипов. Каждый вирион SARS-CoV-2 (вирусная частица) имеет наружную поверхность с 24-40 беспорядочно расположенными спайковыми белками, ключами к слиянию с клетками человека. Для других видов вируса, такие как грипп, белки внешнего слияния являются относительно жесткими. Однако, спайковые белки SARS-CoV-2 очень гибкие и шарнирно соединяются в трех точках согласно работе, опубликованной в августе 2020 года биохимика Мартина Бэка и его коллег, Институт биофизики, Франкфурт, Германия (Martin Beck, Institute of biophysics, Frankfurt, Germany). Это позволяет спайковым белкам вертеться, раскачиваться и вращаться, что может облегчить им сканирование поверхности клетки и связывание нескольких шипов с человеческой клеткой. По словам биохимика Бэка, не существует схожих экспериментальных данных для других коронавирусов, но, поскольку последовательности шипованных белков высоко эволюционно законсервированы, справедливо предположить, что этот признак является общим. В начале пандемии ученые подтвердили, что домен (RBD) спайковых белков SARS-CoV-2 прикрепляется к хорошо знакомому белку, так называемому рецептору ACE2, который украшает внешнюю часть большинства слизистых клеток горла и легких человека. Этот рецептор также является стыковочным пунктом для SARS-CoV, вирус, который вызывает тяжелый острый респираторный синдром (SARS). Однако вирус SARS-CoV-2, связанный с рецептором ACE2, по сравнению с SARS-CoV предполагается в 2-4 раза сильнее, потому что несколько изменений в RBD стабилизируют его горячие точки связывания с вирусом.
Варианты SARS-CoV-2, как правило, имеют мутации в субъединице S1 (subunit S2) белка-шипа, который является хозяином RBD и отвечает за связывание с рецептором ACE2. (Вторая субъединица спайкового белка (subunit S2) вызывает вирусное слияние с мембраной клетки-хозяина). По словам структурного биолога, изучающая мутации спайковых белков Приямвада Ачарая, Дьюкский институт вакцин человека, Дарем, Северная Каролина (Priyamvada Acharaya, Duke Human Vaccine Institute, Durham, North Carolina), к примеру, Альфа вариант (Ailpha variant) включает 10 изменений в последовательности спайкового белка, в результате которых, домен (RBD) вероятнее всего находится в верхней части белка, что облегчает процесс связывания вируса с клеткой. Дэльта вариант (Delta variant), который сейчас распространяется по всему миру включает в себя многочисленные мутации в первой субъединице S1, три в домене (RBD), улучшая его способность связываться с рецептором ACE2 и, таким образом, избегать иммунную систему.
Ограниченный вход
Как только вирусные спайковые белки связываются с рецептором ACE2, другие белки на поверхности клетки хозяина начинают процесс, ведущий к слиянию вирусных и клеточных мембран.
Вирус, вызывающий SARS, SARS-CoV, использует один из двух ферментов протеазы хозяина для проникновения: TMPRSS2 (произносится как "темпресс два" (англ. яз. "tempress two") или катепсин Л (cathepsin L). TMPRSS2 - самый быстрый путь проникновения, однако, вместо этого SARS-CoV часто проникает через эндосому, пузырь, окруженный липидом, который зависит от катепсина Л. При попадании вирионов в клетку этим путем, противовирусные белки могут улавливать их. Отличие SARS-CoV 2 от SARS-CoV в том, что SARS-CoV 2 эффективно использует фермент TMPRSS2, который находится в большом количестве за пределами дыхательных клеток. Сначала, фермент TMPRSS2 делает надрез во втором субъюните спайкового белка. Этот надрез выявляет ряд гидрофобных аминокислот, которые быстро проникают в ближайшую мембрану - мембрану клетки-хозяина. Далее, удлиненный шип складывается обратно, как застежка молнии, заставляя вирусные и клеточные мембраны сливаться (см. рис. 4 «Вирус приближается»).
Рис. 4 Вирус приближается
Мембраны вируса и клетки-хозяина сливаются как только фермент TMPRSS2 надрезает спайковый белок SARS-CoV-2. Это способствует выпуску гидрофобных аминокислот в спайк, которые быстро прикрепляются к ближайшей мембране клетки-хозяина.
Затем вирус выбрасывает свой геном прямо в клетку. Таким образом, проникновение подпружиненным способом SARS-CoV 2 инфицирует клетки быстрее, чем SARS-CoV, избегая попадания в эндосомы согласно статье Барклай и ее коллег, Имперский колледж Лондона (Imperial college London). Несмотря на ранние многообещающие исследования в лаборатории, скоростное проникновение вируса, используя фермент TMPRSS2 объясняет почему хлорохин, лекарство от малярии не работает в клинических исследованиях лечения COVID-19. Так, команда Барклай стала использовать клетки, которые полагаются исключительно на катепсины для входа эндосомы. «Когда вирус передается и размножается в дыхательных путях человека, он не использует эндосомы, поэтому хлорохин, эндосомо-разрушающее лекарство, неэффективен в реальной жизни», говорит Барклай.
Открытие также указывает на то, что ингибиторы протеазы являются перспективным терапевтическим вариантом для предотвращения проникновения вируса в клетку-хозяина с использованием фермента TMPRSS2 или катепсина Л. Так, ингибитор TMPRSS2, мезилат комостата, одобренный в Японии в качестве лечения панкреатита (воспаления поджелудочной железы), блокировал проникновение вирусных частиц в клетки легких, однако, лекарство не улучшило итоговые результаты пациентов в первоначальном клиническом исследовании. «С моей точки зрения, нам нужно иметь такие ингибиторы протеазы, как широкий спектр доступных противовирусных препаратов для борьбы со вспышками новых заболеваний и предотвращения будущих пандемий на начальном этапе», говорит Стефан Польман, директор инфекционного биологического отделения, Немецкий центр приматологии, Геттинген (Stefan Pohlmann, German Primate Center, Gottingen), который руководил исследованиями связывания рецептора ACE2 с RBD и ролью фермента TMPRSS2 в процессе заражения.
Смертельная конкуренция
Следующие шаги инфицирования более непонятные. «Как только вы попадаете в клетку, появляется намного больше черных ящиков. Там больше неопределенности и конкурирующих гипотез», по словам химика Джанет Иваса, Университет Юты, Солт-Лейк-Сити (Janet Iwasa, University of Utah, Salt Lake City), которая разрабатывает аннотированную анимацию жизненного цикла вируса. После того как вирус вводит свой геном РНК в клетку, рибосомы в цитоплазме транслируют два участка вирусной РНК в длинные цепочки аминокислот, которые распадаются на 16 белков, большинство которых участвуют в синтезе РНК. Большинство сформированных РНК кодируют в общей сложности 26 известных вирусных белков, включая структурные, например спайковые белки, которые используются для создания новых вирусных частиц и других вспомогательных белков. Таким образом, вирус начинает создавать копии своей собственной информационной РНК. Однако, ему необходимы механизмы клетки для преобразования своих мРНК в белки.
Коронавирусы захватывают этот механизм в течение многих лет. Вирусолог Ноам Стерн-Гиноссар со своей командой, Институт науки Вайцмана, Реховот, Израиль (Noam Stern-Ginossar, Weizmann institute of Science, Rehovot, Israel) рассмотрели три механизма с помощью которых SARS-CoV 2 подавляет трансляцию мРНК хозяина в пользу собственной. Ни один не является эксклюзивным для этого вируса, однако, сочетание, скорость и масштабы воздействия кажется уникальными.
Во-первых, вирус устраняет конкуренцию: вирусный белок Nsp1, один из первых белков, транслируемых при появлении вируса, привлекает белки хозяина для систематичного расчленения всех клеточные мРНК, не имеющих вирусных меток. Однако, когда команда вирусолога Стерна-Гиноссара поставила вирусную метку на конец мРНК клетки-хозяина, мРНК не была разрезана.
Во-вторых, инфекция сокращает в целом трансляцию белка в клетке на 70%. Белок Nsp1 снова остается главным виновником, в этот раз физически блокируя входной канал рибосом так, что мРНК не может попасть внутрь. Небольшая оставшаяся способность к трансляции предназначена для вирусных РНК, согласно исследованиям ученых.
Наконец, вирус останавливает работу защитной системы клетки. Это происходит различными путями, однако, команда вирусолога Стерна-Гиноссара обнаружила один точный механизм для SARS-CoV-2: вирус предотвращает выход клеточной мРНК из ядра, включая работу белков, предназначенных предупреждать иммунную систему об инфекции. Вторая команда подтвердила это открытие и снова указала на вирусный белок Nsp1, как будто белок перекрывает выходные каналы в ядре так, что ничто не может ускользнуть.
Так как транскрипты генов не могут выбраться из ядра, поэтому инфицированные клетки не выделяют много интерферонов – это сигнальные белки, которые предупреждают иммунную систему о присутствии вируса. SARS-CoV-2 особенно эффективен при блокировании сигнальной системы: по сравнению с другими респираторными вирусами, включая SARS-CoV и респираторно-синцитиальный вирус, инфицирование SARS-CoV-2 значительно снижает уровень интерферонов. Однако, в июне этого года, ученые сообщили о мутациях Алфа варианта, который позволяет подавить выработку интерферонов даже более эффективно. По словам Стерна-Гиноссара, очевидно, что SARS-CoV-2 очень быстрый вирус, который обладает уникальной способностью предотвращать распознавание нашей иммунной системой и борьбы с ней на первых стадиях. К тому моменту, как иммунная система, наконец, определяет существование вируса, которого так много, что белки иммунного ответа могут наводнять кровоток быстрее, чем обычно – это может привести их к разрушению. Ранее в пандемию, врачи обратили внимание, что некоторые люди, болеющие в тяжелой форме COVID-19, пострадали от сверхактивного иммунного ответа к SARS-CoV-2, также как от самого вируса. Некоторые проверенные методы лечения работают, подавляя этот иммунный ответ.
Станция реконструкции
Как только вирус принимает на себя трансляцию клетки хозяина, он начинает преображение дома, значительно модифицируя внутреннее и внешнее состояние клетки в соответствии со своими потребностями.
Сначала, некоторые новоиспеченные вирусные спайковые белки перемещаются на поверхность клетки, высовываясь из мембраны клетки-хозяина. Затем, они активируют кальциево-ионный канал, который вытесняет жировое покрытие на внешнюю часть клетки – такое же покрытие обнаружено на клетках, которые естественно сливаются вместе, такие как мышечные клетки. В этот момент, инфицированная клетка сливается с соседними клетками, экспрессирующие рецептор ACE2, превращаясь в большие отдельные респираторные клетки, содержащие вплоть до 20 ядер.
Слитые клеточные структуры (синцитии) в клетках, экспрессирующих спайковый белок SARS-CoV-2 (зеленый). Ядра окрашены в синий цвет, а клеточный скелет - в красный.
Такие слившийся конструкции называются синцитиями, которые вызваны вирусными инфекциями, такие как ВИЧ и вирус простого герпеса, но не вирусом SARS, утверждает молекулярный биолог Мауро Джакки, Королевский колледж Лондона (Mauro Giacca, King’s College London), возглавивший команду ученых, опубликовавших результаты исследования в апреле. Он предполагает, что сформированный синцитий позволяет инфицированным клеткам процветать в течение долгого времени, штампуя больше и больше вирионов. «Это не случайный вирус, который поражает и убегает, он сохраняется», говорит биолог.
Другая команда под руководством Цян Сунь, Китайская академия медицинских наук, Пекин (Qiang Sun, the Chinese Academy of Medical Science, Beijing) обнаружила, что некоторые инфицированные клетки COVID-19 даже формируют синцитий с помощью лимфоцитов – одной из собственных иммунных клеток организма. Это известный механизм уклонения иммунной системы опухолевыми клеткам, но не вирусами. Это указывает на то, что инфицированные клетки избегают иммунного обнаружения, просто цепляясь за ближайших иммунных разведчиков и сливаясь с ними. Внутри клетки происходит еще больше изменений. Как и другие коронавирусы, SARS-CoV-2 трансформирует длинный тонкий эндоплазматический ретикулум (ЭР) (endoplasmic reticulum, ER), сеть плоских мембран, участвующих в синтезе и транспорте белков, в двухмембранные сферы, как если бы ЭР пускал пузыри. Эти двухмембранные везикулы (ДМВ) (double-membrane vesicles, DMV) могут обеспечить безопасное место для репликации и трансляции вирусной РНК, защищая ее от сенсоров врожденного иммунитета в клетке. Однако, эта гипотеза все еще исследуется.
Белки, участвующие в производстве ДМВ, могут быть хорошими мишенями для лекарств, потому что они, по-видимому, необходимы для репликации вируса. Например, белок-хозяин TMEM41B необходим для мобилизации холестерина и других липидов для пролиферации мембран ЭР, чтобы все части вируса поместились внутри. «Как только вы блокируете белок TMEM41B, он может снизить серьезное влияние на процесс инфекции», - говорит Винит Менахери, исследователь коронавируса из Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне (Vineet Menachery, University of Texas Medical Branch, Galveston), принимавший участие в исследовании. Трансмембранный белок коронавируса Nsp3 также может быть мишенью: он создает короноподобную пору в стенках ДМВ, чтобы удалять вновь образованную вирусную РНК.
Большинство вирусов, имеющих внешнюю оболочку, известную как «энвейлоп» (англ. envelope), образуют эту структуру путем сборки непосредственно на краю клетки, кооптируя часть собственной плазматической мембраны клетки на своем пути. Но белки коронавируса идут другим путем. В течение многих лет данные свидетельствовали о том, что коронавирусы транспортируются из клетки через комплекс Гольджи, органеллу, которая работает как почта, упаковывая молекулы в мембраны и отправляя их в другие части клетки. Там вирус образует липидную оболочку из мембраны комплекса Гольджи. Затем вновь образованные вирионы переносятся внутри пузырьков Гольджи на поверхность клетки, где они выдавливаются из клетки, говорит вирусолог и клеточный биолог Кэролайн Мачамер из Университета Джона Хопкинса в Балтиморе, штат Мэриленд (Carolyn Machamer, Johns Hopkins University, Baltimor, Maryland), которая изучает коронавирусы в течение 30 лет.
Однако в декабре клеточный биолог Нихал Алтан-Боннет из Национального института сердца, легких и крови США в Бетесде, штат Мэриленд (Nihal Altan-Bonnet, Institute in Bethesda, Maryland), и ее коллеги сообщили, что они обнаружили коронавирусы, покидающие клетку через лизосомы - ящики для клеточного мусора, заполненные ферментами, которые частично разрушают клетки. По словам Алтан-Боннета, блокирование секреторного пути, основанного на Гольджи, не повлияло на количество выделяемого инфекционного вируса. Согласно доказательствам ее команды, предполагается, что вирусные белки образуют оболочку, попадая в ЭР, а затем захватывают лизосомами, чтобы выбраться из клетки. В настоящее время исследователи тестируют ингибиторы, которые блокируют процесс выхода из лизосом, в качестве потенциальных противовирусных кандидатов.
Выход клетки через Гольджи, так и через лизосомы происходит медленно и неэффективно по сравнению с отпочкованием из плазматической мембраны, поэтому ученые не знают, почему SARS-CoV-2 делает это. Мачамер подозревает, что липидный состав оболочки, полученной из Гольджи или лизосом, каким-то образом более полезен для вируса, чем липидная композиция из плазматической мембраны. «Если бы мы немного лучше поняли эту часть, то открылись бы большие возможности для новых противовирусных препаратов», - говорит она.
Последний надрез
На выходе из клетки еще одно событие превращает вирус в инфекционный гигант: быстрый надрез на участке, состоящем из пяти аминокислот, подготавливает вирус к поражению следующей цели. Между тем другие коронавирусы имеют одну аминокислоту «аргинин» на пересечении субъединиц S1 и S2 спайка, однако, SARS-CoV-2 имеет линию из пяти аминокислот: пролин, аргинин, аргинин, аланин и аргинин. По словам Пёльманна: «так как этот участок был необычным, мы сосредоточились на нем, и оказалось, что действительно он необходим для инвазии клеток легких». В мае 2020 года он и его коллеги сообщили, что белок клетки-хозяина, так называемый «фурин», распознает и отсекает эту последовательность аминокислот - и разрез существенно необходим для эффективного проникновения вируса в клетки легких человека.
Это не в первый раз, когда исследователи обнаружили участок расщепления фурином на вирусе, он также есть у высокопатогенных вирусов птичьего гриппа, говорит Барклай. Когда коллега отправила Барклай штамм SARS-CoV-2 в культурной среде, которая спонтанно потеряла участок расщепления фурином, ее команда обнаружила, что хорьки, инфицированные этим штаммом, выделяют вирусные частицы в меньших количествах, чем хорьки, инфицированные пандемическим штаммом, не передавая инфекцию рядом находящимся животным. В то же время, когда команда Барклай сообщила о своих результатах в препринте за сентябрь 2020 года, в исследование в Нидерландах было также обнаружено, что коронавирус с цельным участком расщепления фурином проникает в дыхательные клетки человека быстрее, чем без него.
Предполагается, что фурин делает надрез на участке в какой-то момент во время сборки вириона или непосредственно перед его выпуском. Выбор момента может объяснить, почему вирус выходит через Гольджи или лизосомы, говорит Том Галлахер, вирусолог из Университета Лойола в Чикаго в Иллинойсе (Tom Gallagher, Loyola University, Chicago, Illinois). «Собранный вирус перемещается в органеллу, где омывается протеазой фурина».
Разрывая связь между субъединицами S1 и S2 спайка, разрез фурина ослабляет белки шипов вириона, так что во время входа в клетку они реагируют на второй разрез TMPRSS2, обнажающий гидрофобную область, которая быстро погружается в мембрану клетки-хозяина, говорит Галлахер. Если шипы предварительно не обрезаны фурином - а это происходит не всегда - они обходят TMPRSS2 и проходят через более медленный эндосомный путь.
Два варианта коронавируса, Alpha и Delta, изменили участки расщепления фурина. В варианте Alpha исходная аминокислота пролина заменена на гистидин (P681H), в варианте Дельта она заменена на аргинин (P681R). Оба изменения делают последовательность менее кислой, и чем более щелочная последовательность аминокислот, тем эффективнее фурин распознает и разрезает ее, говорит Барклай. «Мы могли бы предположить, что этот вирус передается еще лучше». Чем больше разрезов фурина, тем больше белков-шипов, предназначенных для проникновения в клетки человека. При SARS-CoV праймировано (готово к проникновению) менее 10% белков-шипов, говорит Менахери, чья лабораторная группа проводила количественную оценку праймированных белков-шипов, но еще не опубликовала эту работу. В SARS-CoV-2 этот процент возрастает до 50%, в альфа-варианте больше 50%. Группа обнаружила, что в высокотрансмиссивном варианте Delta более 75% спайков предназначены для инфицирования человеческих клеток.
Известный остается неизвестным
Научное сообщество все еще пытается понять SARS-CoV-2. По словам ученого Маклеллан для начала остаются ключевые нераскрытые факты о коронавирусе:
- количество рецепторов ACE2, необходимых для связывания с каждым белком-спайком;
- когда именно участок субъединицы S2 расщепляется TMPRSS2;
- количество шипов, необходимых для слияния вируса с клеточной мембраной.
В апреле 2020 года группа из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (University of California, San Francisco) выявила как минимум 332 взаимодействия между SARS-CoV-2 и человеческими белками.
Нелегко успевать за быстро мутирующим вирусом. Однозначно эксперты соглашаются, что до сих пор большинство мутаций связано с тем, насколько эффективно распространяется вирус, а не с тем, насколько вирус повреждает клетку хозяина. В этом месяце исследование показало, что вариант Дельта рос быстрее и на более высоких уровнях в легких и горле людей, чем более ранние штаммы вируса. Однако все еще остается не ясным, насколько сильно мутации Дельты изменят штамм, говорит Стерн-Гиноссар. «Это то, что пытаются выяснить многие лаборатории».
Перевод выполнила: переводчик Судник Екатерина Викторовна, г. Москва
Источники:
- Журнал Nature, выпуск 595, стр. 640-644 (2021), https://www.nature.com/
- Анимационная лаборатория, ПОСТРОЕНИЕ ВИЗУАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ЖИЗЕННОГО ЦИКЛА SARS-COV-2, https://animationlab.utah.edu/cova