Химикаты
Кверцетин, катехин, нарингенин, 1,1-дифенил-2 пикрилгидразильный радикал (DPPH), гипохлорит натрия (NaOCl), восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, мелатонин и другие химические вещества были от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США или Штайнхайм, Германия). Метанол, этанол и другие органические растворители и реагенты были аналитической чистоты, закуплены в Реахиме (Москва, Россия) и использовались без дополнительной очистки. Флавоноиды использовали в виде свежеприготовленных исходных растворов (15 мМ) в этаноле. В предварительных экспериментах мы показали, что этанол в используемом диапазоне концентраций не влияет на измеряемые параметры. Все растворы были приготовлены на воде, очищенной в системе Milli-Q.
Расчет геометрии молекул и электронных свойств флавоноидов
Молекулы флавоноидов были рассмотрены теоретически путем выполнения как полуэмпирической теории молекулярных орбиталей, так и расчетов ab initio. Полуэмпирический метод Остина 1 (AM1) в рамках неограниченного формализма Хартри – Фока (UHF) в приближении самосогласованного поля и алгоритм Полака – Рибиера были рассмотрены для полной оптимизации геометрии молекул флавоноидов. Электронная структура систем рассчитывалась неэмпирическим методом [ 22 , 23 ]. Все расчеты проводились в программном пакете HyperChem-8.0 (HyperCube, Inc.) для поиска конформаций с минимальной энергией [ http://www.hyper.com]. Энергия отрыва атома водорода рассчитывалась как разность энергий связи молекулы флавоноида и соответствующего радикала, образующегося после удаления атома водорода каждой гидроксильной группы.
Определение параметров взаимодействия DPPH – флавоноид.
Активность флавоноидов по улавливанию радикалов в отношении стабильного радикала DPPH оценивали путем регистрации кинетики восстановления DPPH флавоноидами. Вкратце, 10 мкл флавоноидов в различных концентрациях (этанол растворов) добавляли к 1990 мкл раствора ДФПГ (100 мкМ в этаноле) при 10 - 40 ° С. За восстановлением DPPH следили спектрофотометрически по изменению его оптической плотности при 520 нм с помощью спектрофотометра Jasco V-650 UV-VIS (Япония). Мы оценили параметры взаимодействий DPPH – флавоноид (стехиометрия, кажущиеся константы скорости, энергия активации) с помощью формул. ( 1 ) и ( 2 ). Уравнение скорости снижения DPPH может быть представлено следующим образом:
v = kcп,v=kcn,
(1)
где v - кажущаяся скорость восстановления, n - порядок реакции, а k - кажущаяся константа скорости восстановления DPPH. Кажущиеся скорости реакций восстановления оценивали по временным зависимостям восстановления DPPH при варьировании концентраций флавоноидов (2,5–20 мкМ). Для расчетов кажущейся константы скорости и порядка реакции мы представили уравнение. ( 1 ) в виде логарифма ln v = ln k + n ln c . Представляя зависимость скорости реакции от температуры согласно уравнению Аррениуса. ( 2) рассчитывалась энергия активации переноса электрона на радикал DPPH:
v = A exp( - Δ Eа /R T) ,v=Aexp(−ΔEa/−ΔEaRTRT),
(2)
где v - скорость восстановления DPPH при температуре T (K), A - предэкспоненциальный множитель, R - газовая постоянная, а Δ Ea - энергия активации восстановления.
Автоокисление и хлорирование флавоноидов
Автоокисление флавоноидов контролировали спектрофотометрически в течение 3 ч, регистрируя прогрессивные изменения в спектрах поглощения во время инкубации флавоноидов (50 мкМ) в открытых пробирках в темноте в этаноле / Na-фосфатном буфере, pH 7,4, смеси (30% / 70%) при 10 ° C. –50 ° C при осторожном перемешивании. Мы использовали фосфатно-солевой буфер (PBS: 0,15 моль л -1 NaCl, 1,9 ммоль л -1 KH 2 PO 4 , 8,1 ммоль л -1 K 2 HPO 4 , pH 7,4). Предотвращение автоокисления флавоноидов антиоксидантами оценивали при инкубации в присутствии 100 мкМ восстановленного глутатиона, аскорбиновой кислоты или мелатонина.
Для хлорирования флавоноиды (50 мкМ) инкубировали с 25, 50, 75, 100 мкМ хлорноватистой кислоты (HOCl) в смеси этанол / Na-фосфат, pH 7,4, смесь (30% / 70%) в течение 1 мин при осторожном перемешивании. и 25 ° C, и записывали спектры поглощения.
HOCl-индуцированный гемолиз: эффекты флавоноидов
Эритроциты выделяли из гепаринизированной крови крыс центрифугированием (1500 об / мин, 5 мин при 4 ° C). После удаления плазмы и лейкоцитарного слоя эритроциты трижды промывали холодным (4 ° C) физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS, pH 7,4). Эритроциты использовали сразу после выделения. Уход и процедуры, выполняемые на крысах, были одобрены этическим комитетом Института биохимии биологически активных соединений Национальной академии наук Беларуси (протокол № 22/15 от 01.10.2015 г.) и соблюдены Национальным институтом здоровья. Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (Публикации NIH № 8023, пересмотр 1978 г.).
При pH 7,4 раствор гипохлорита натрия (NaOCl) содержал смесь HOCl и NaOCl в соотношении примерно 1: 1 и впоследствии был назван HOCl [ 24 ]. Восприимчивость эритроцитов к повреждению, вызванному хлорноватистой кислотой, измеряли как скорость гемолиза. Суспензию эритроцитов (гематокрит 0,05%) смешивали с различными концентрациями HOCl (5–75 мкМ) в PBS, pH 7,4, при 25 ° C, и кинетические кривые гемолиза определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности суспензии при температуре 25 ° C. 670 нм и 25 ° C в присутствии или отсутствии флавоноидов. Суспензии эритроцитов предварительно инкубировали с флавоноидами в течение 5 мин перед введением HOCl.
статистический анализ
Результаты экспериментов выражали как среднее значение четырех или пяти повторов ± SEM. Различия между значениями параметров, измеряемых в группах, анализировали с помощью t- критерия Стьюдента или непараметрического критерия Манна – Уитни в зависимости от нормальности значений распределения в группах. Нормальность распределения определялась с помощью критерия Шапиро – Уилка. Статистический анализ проводился с использованием программного пакета GraphPad Prism 6.0 ( https://www.graphpad.com/quickcalcs ). Предполагалось, что результаты были статистически значимыми по сравнению со значениями контрольной группы, когда значение p было меньше 0,05.