Большинство процессов в нашем организме (кроме стохастических неферментативных, о которых мы скажем отдельно, да и то тоже связаны) так или иначе контролируются продуктами генов, белками, РНК. Гены контролируют практически всё. Именно из-за генов мы наблюдаем разницу в продолжительность между видами в миллионы раз.
Из-за изменения работы небольшого числа генов мы видим отличие в продолжительности близких видов на порядок.
Работа генов определяет скорость старения, скорость накопления ошибок и развитие патологических состояний.
Отсюда следует наше логичное желание «подправить» работу генов в нужном нам направлении, ослабить или усилить их активность.
На данный момент для этого в нашем арсенале есть генная терапия. О ней уже рассказывал Черч в интервью из первого аргумента, разовьем эту тему сейчас и продолжим дальше.
Многие, наверное, слышали о системе CRISPR-Cas. Аббревиатура CRISPR расшифровывается как “clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, «скопление разделенных регулярными промежутками коротких палиндромных (то есть симметричных) повторов». Cas - связанный с CRISPR белок, эндонуклеаза, разрезающая чужеродную ДНК.
CRISPR-Cas - адаптивная (приобретенная) иммунная система, которая в геноме прокариот хранит память о встречах с чужеродной ДНК, принадлежащей мобильным генетическим элементам (МГЭ) и вирусам (бактериофагам).
Фрагменты чужеродной ДНК содержатся в геноме бактерий в специальной «картотеке», в уникальных спейсерных последовательностях, полученных из МГЭ и вирусов и вставленных между повторами в CRISPR. При новом вторжении чужеродной ДНК транскрипты спейсеров (разделителей) CRISPR используются для распознавания родственных последовательностей паразитов и направления нуклеаз Cas к их уникальным сайтам-мишеням. И далее - к инактивации паразитов.
В 2012-2013 годах две группы исследователей, Эммануэля Шарпантье и Фенга Жанга, независимо друг от друга показали возможность использования системы CRISPR-Cas для редактирования генома.
В последствии было разработано несколько улучшенных модификаций инструментов по редактированию генома на основе CRISPR-Cas. В их числе – редактора нуклеотидных оснований.
Технология «редактирования оснований» (base editing) появилась в 2017 году. В чем же её отличие от предыдущих инструментов-редакторов генома?
В ходе редактирования ученые разрезали обе цепи ДНК с последующим восстановлением двойных разрывов. Это имело свои отрицательные стороны — например, возникали ошибки, нежелательные вставки и выпадения нуклеотидов. Редактор оснований, в котором используется мутантный белок Cas9, обходится без разрывов цепей ДНК, делая нуклеотидные замены цитозина на тимин (C→T), гуанина на аденин (G→A), аденина на гуанин (A→G) и тимина на цитозин (T→C).
В 2017 году китайские ученые, используя редактор оснований, смогли частично исправить генетическую мутацию у клонированных человеческих эмбрионов, связанную с развитием β-талассемии — заболеванием крови, связанном с тяжелой анемией. Положительного результата удалось добиться у 8 из 20 эмбрионов.
После этого пришло время показать себя исследователям из Гарвардского университета, команде David Liu. В 2019 году они провели работу, в которой редактор оснований делал как однонуклеотидные замены, так и крупные вставки и делеции. Вот как они написали в об этом в своей работе.
«Здесь мы описываем универсальный и точный метод редактирования генома, который напрямую записывает новую генетическую информацию в указанный участок ДНК с использованием измененной эндонуклеазы Cas9, слитой со сконструированной обратной транскриптазой. Они программируются посредством первичной направляющей РНК, которая определяет целевой сайт и кодирует желаемое редактирование. Мы выполнили более 175 изменений в человеческих клетках, включая целевые вставки, делеции и все 12 типов точечных мутаций, при этом не допустив двухцепочечных разрывов ДНК».
По предположению авторов, их метод может исправить до 89% известных генетических вариантов, связанных с заболеваниями человека.
В работе 2020 года эта же команда смогла с помощью редактора оснований исправить генетическую мутацию, вызывающую прогерию Хатчинсона-Гилфорда. Это было сделано в экспериментах на клеточных культурах (фибробластах пациентов с прогерией) и мышиной модели этой патологии.
В совсем недавней работе ученые смогли с помощью редактора оснований целенаправленно деактивировать ген PCSK9 в печени макак. Этот ген регулирует активность рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Как уже известно, пониженная активность этого гена связана с падением уровня ЛПНП и снижением риска возникновения атеросклероза.
В другом свежем исследовании этого года ученые использовали генную терапию для подавления эндогенного сигнального пути Hippo в кардиомиоцитах свиней на модели инфаркта миокарда. С помощью аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) был проведён нокаут гена Salvador (Sav), ключевого элемента в сигнальном пути Hippo.
Этот сигнальный путь контролирует размер органов животных. Активация сигнального пути Hippo приводит к замедлению размножения клеток (пролиферации) и усилению процессов апоптоза. Подавление же активности этого пути заставляло кардиомиоциты делиться, что приводило к эффективному обновлению тканей и улучшению функции сердца у свиней.
Помимо редактирования оснований ДНК инструменты на основе CRISPR-Cas, сейчас активно исследуются для редактирования РНК и эпигеномных модификаций. Это дает нам ещё одну потенциальную возможность изменять активность генов без внесения изменений в саму ДНК.
Так, R. Batra с коллегами сконструировали РНК-специфичную систему CRISPR, эндонуклеазу РНК, слитую с белком Cas9, названную RCas9. Как показали эксперименты на культуре клеток пациентов с миотонической дистрофией 1типа, RCas9 устраняла дефекты сплайсинга, разрушая «мусорную» микросателлитную РНК. Накопление этой РНК, кроме мышечных дистрофий, характерно также для неврологических патологий (болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза).
В другой недавней работе ученым удалось создать на основе белка Cas9 гибридный белок CRISPRoff, который программирует наследственную эпигенетическую память. CRISPRoff может активировать метилирование целевых генов, заставляя их «замолчать».
Заставить «замолчать» какой-нибудь «плохой» ген, связанный с патологиями и старением - это конечно хорошо. Однако было бы наверное также неплохо научиться активировать «полезные» гены, активность которых снижается со старением. Например гены, кодирующие антиоксидантные ферменты или сиртуины.
В одной из работ 2021 года X. Zhang с коллегами на основе белка Cas9 бактерии Campylobacter jejuni (одного из самых маленьких белков этого семейства) создали miniCAFE, инструмент для активации выбранных генов-мишеней. Доставленная посредством универсального аденоассоциированного вируса (AAV), miniCAFE показала способность активировать экспрессию одного из генов, регулирующих энергетический метаболизм — гена Fgf21 в печени мышей.
Несколько исследований показали, что белок FGF21 стимулирует термогенез «полезных» коричневой и бежевой жировой ткани, помогает снизить массу тела и улучшает чувствительность к инсулину у грызунов.
В исследовании 2020 года японские биологи смогли активировать ген Fgf21, убрав метилирование его промотора (важной для активации части гена) посредством CRISPR/dCas9-опосредованного редактирования эпигенома.
Естественно, всё это ещё не старение. Нам только предстоит установить, работу каких генов, мы хотим изменить, чтобы добиться увеличение продолжительности жизни человека. Всю информацию генах ассоциированных со старением мы собираем в нашей базе Open Genes.
С большой уверенность можно предположить, что технологий на основе CRISPR-Cas, будут становиться все точнее и станут одной из основных терапий множества патологий.
Начало этому уже положили компании Vertex Pharmaceuticals и CRISPR Therapeutics во главе с Эммануэль Шарпантье, в 2012 году создавшей первый редактор на основе CRISPR-Cas. Они провели клинические исследования и получили одобрение контролирующих органов на использование своей технологии редактирования генома для терапии двух видов анемий, серповидно-клеточной анемии и трансфузионно-зависимой бета-талассемии.
Подписывайтесь на наш телеграм канал @thisbiohack
Источник: https://forum.cchia.ru/threads/shturm-i-natisk-gennoj-terapii.4746/