Когда говорят о ковиде (а о нем говорят больше, чем о российском футболе, надо же!), то очень часто упоминают ПЦР. Думаю, было бы неплохо знать, так как эти явления действительно связаны и от них мы все зависим.
Представьте себе несколько ситуаций. Первая: человек заразился вирусной инфекцией, симптомы её похожи на симптомы других заболеваний. Сейчас можно максимально быстро и точно определить возбудителя уже на первых этапах развития заболевания.
Ситуация вторая: на месте преступления был найден только один волос преступника. Есть ряд подозреваемых, как определить преступника?
Третий пример: археологи нашли среди окаменелостей остатки молекул ДНК неизвестного вымершего организма. Даже такого малого количества ДНК достаточно, чтобы, например, определить родство с нынешними организмами.
Что объединяет эти три ситуации? Ничтожно малое количество генетического материала (ДНК). ПЦР увеличивает количество генетического материала.
Миллионы людей делают анализ на вирус ковида, и ПЦР здесь – очень важный диагностический помощник врача.
Итак, ПЦР – это полимеразная цепная реакция. Ничего не понятно, правда? Сейчас очень коротенько поясню, «ху из ху». «Полимеразная» - то есть из исходной длинной молекулы делают копии, соединяя, как бусинки на нитке, её одинаковые частички. «Цепная», то есть одни реакции вызывают вторые, вторые – третьи и так далее.
В первой части, которая выделена курсивом, расскажу теорию. Если вам теория неинтересна, тогда бегом ко второй части, практической (как используют ПЦР).
ПЦР — это метод, который позволяет многократно увеличить малые количество определённых фрагментов ДНК в в миллионы раз (!) в течение нескольких часов. Разработан в 1983 году американским ученым Кэри Муллисом, за что спустя всего десять лет он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 (разделил ее с Майклом Смитом). Замечу, совершенно справедливо. Благодаря талантам этих мужиков теперь врачи спасают тысячи и тысячи жизней.
Как делают ПЦР? Сначала идет подготовка реакционной смеси: в одну пробирку помещают все необходимые компоненты. Длится этот этап обычно до часа.
Реакционную смесь готовят в специально предназначенных для ПЦР маленьких пробирках Эппендорфа. Сам процесс несколько напоминает варку супа: картошка, капуста, морковка, горох….ох!
Здесь картошка не поможет, нужна ДНК-матрица, то есть та ДНК, которая имеет необходимый для копирования фрагмент.(Матрицей может быть любая молекула ДНК любого организма, её специально выделяют). Необходим фермент ДНК-полимераза, он ускоряет реакцию в тысячи раз. Необходимы «кирпичики», из которых и будут строиться бесчисленные копии нужной ДНК – это нуклеотиды. Нужны праймеры – короткие фрагменты ДНК. нужные для начала работы фермента ДНК-полимеразы. Фермент ДНК-полимераза – штука капризная, для его активности требуются ионы магния, а то работать не будет. Наконец, не будет наш «суп» вкусным без «соли»: это всякие ионы хлора, натрия, калия и проч. – т. н. ПЦР-буфер. Ну и, конечно, вода! Начинаем «варить».
Для этого пробирки со смесью помещают в специальный прибор и оставляют на несколько часов, обычно 3-6.
Первая стадия называется денатурация или плавление. Смесь нагревают до 94-98 °С. При этом к ДНК-матрице присоединяются праймеры. Здесь, как в поварском искусстве, важно подобрать оптимальную температуру, а то праймеры не присоединятся к ДНК.
Теперь всё готово для работы привередливого фермента; он начинает удлинять праймеры в соответствии с ДНК-матрицей. То есть делает одну копию за другой. И делает это лихо: тысячу кирпичиков-нуклеотидов соединяет меньше чем за 1 минуту.
«Варка» закончена, надо «снять пробу»: проверить качество и количество продуктов ПЦР методом гель-электрофореза, проще говоря, разделяют полученные молекулы в электрическом поле или другим способом.
Теперь – обещанная вторая часть, практическая. Где можно применять ПЦР? В науке:
Увеличение числа копий нужного фрагмента ДНК
Поиск нужного фрагмента ДНК
Клонирование генов, то есть создание миллионов копий
Определение последовательности ДНК
Направленные мутации ДНК – это поясню: до сих пор мутации – случайный процесс, когда, где и в чем будет заключаться мутация – процесс тёмный, непредсказуемый. Пример, правда, жесткий: когда, в каком месте и у кого произойдёт раковая мутация – неизвестно, но ведь происходит, то-то и оно…
Установление родства организмов.
В медицине:
Диагностика инфекций
Диагностика генетических заболеваний, включая изучение наследственности ещё неродившегося ребёнка, плода (!)
Персональная медицина: лекарства, лечение назначается с учётом индивидуальных наследственных особенностей. (Кто-то снисходительно улыбнулся, дескать, какие там наследственные особенности, укол нормально сделать не могут! Могут, не всё, но могут многое, что раньше и не снилось. Кто теперь вспомнит про видеомагнитофоны или бобинные магнитофоны 70-80-х годов? А прошло лет 25-40 – мгновение).
Установление отцовства (смотрите ТВ-передачу «ДНК»? Вот там используют ПЦР).
В криминалистике: установление личности. Даже если человек исчез 20 или 30 лет назад, по останкам можно установить личность или найти преступника через много лет; примеры есть.
Наконец, о ковиде. В первые дни после заражения вирус активно размножается в эпителии носоглотки. Поэтому для диагностического теста на COVID-19 медицинский работник берет образец слизи из носа, горла или образец слюны. Образец герметично закрывается в пробирке и отправляется в лабораторию для анализа. ПЦР-диагностика отличается от экспресс-тестов, которые проверяют наличие защитных антител в крови. Она выявляет наличие самого вируса в организме. ПЦР-тестирование проводится в лаборатории и может помочь найти даже крошечное количества вируса. Анализ позволяет обнаружить возбудителя инфекции при наличии в пробе буквально нескольких молекул РНК вируса.
В принципе, всё делается, как я уже описал:
-выделяют наследственное вещество вируса из образцов исследуемого материала. (Здесь работа несколько посложней, так как у вируса ковида наследственное вещество – это РНК).
-Поэтому РНК надо «перевести» в ДНК, это делать умеют.
-Затем понятно: с полученными ДНК проводится реакция многократного копирования участков при помощи праймеров….
-В составе реакционной смеси есть светящиеся зонды (маркеры), которые соединяются с участками копируемых ДНК. Больше копий ДНК – ярче свечение. прямо в режиме «реального времени». А нет копий, нет ПЦР, нет заражения – и свечения нет!
И все эти сложности и хитрости идут автоматически, с помощью специального прибора. Лаборант, кто это проводит, может покурить или с лаборанткой «шуры-муры» закрутить…
Надеюсь, сограждане. статья не была слишком сложной. И вы много узнали, чтобы понимать что же с нами делают-то люди в белых халатах. Всем здоровья, не забудьте, пожалуйста, отметить добром старания автора!