Сегодня полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко используется для диагностики многих инфекционных заболеваний, в том числе и новой коронавирусной инфекции. И если ранее такая диагностика считалась слишком дорогой для массового использования, то теперь не только частные центры и лаборатории, но и простые поликлиники и больницы применяют ПЦР во многих сомнительных инфекционных случаях.
Репликация ДНК
В своей основе ПЦР дублирует процессы синтеза молекул ДНК, которые в норме ежедневно происходят в нашем организме, поэтому для понимания механизма проведения реакции, необходимо поговорить о том, как наши клетки в норме осуществляют увеличение генетического материала.
Удвоение количества ДНК - это необходимое условие для осуществления деления клетки, ведь в каждую дочернюю клетку должно попасть одинаковое количество генов. Еще в школьные годы нас учили тому, что молекула ДНК представляет из себя двунитевую спираль, и в таком состоянии она инертна, то есть не может вступать в биохимические реакции. Для того, чтобы клетка смогла произвести увеличение молекул, необходимо ДНК разделить на две отдельные нити, и при этом разделении открываются участки, с которых может считываться информация. Само разделение осуществляется с помощью специальных ферментов - ДНК-гираза, хеликаза. Мы не будем рассматривать механизм их действия, поскольку в этом нет необходимости для понимания сегодняшней темы, главное, что благодаря ним двунитевая молекула разделилась и стала активна.
Далее к каждой нити подходит фермент ДНК-полимераза, который из плавающих повсюду нуклеотидов собирает еще одну нить, комплементарную первой. Опять же, не будем вдаваться в подробности, возможно, раскроем этот механизм в отдельной статье про ДНК, главное, что благодаря этой комплементарности фермент точно знает, какую нить необходимо ему синтезировать. После того, как образовалось две новых двунитевых молекулы, фермент ДНК-лигаза сшивает их, образуя полноценные молекулы ДНК.
То же, но в пробирке
Как уже говорилось, полимеразная цепная реакция аналогична той, что происходит внутри нашей клетки. Главным отличием является то, что образование новых молекул не кончается на двух, а продолжается до тех пор, пока поддерживаются необходимые условия или пока есть необходимый субстрат для синтеза этих молекул.
Начнем. Представим, что у нас в пробирке залита особая среда - буферный раствор. Эта жидкость содержит определенное количество ионов, солей, белков, нуклеотидов и способна поддерживать свою кислотность на одном уровне. В эту среду необходимо добавить ДНК бактерии или вируса, чтобы мы могли ее увеличить. Откуда ее взять? Из любой биологической жидкости, где может присутствовать возбудитель заболевания - слизь из носа, ротоглотки, рвотные массы, испражнения, моча, кровь. Мы помещаем материал, содержащий или не содержащий возбудителя, в данную среду, где, в первом случае, происходит высвобождение ДНК возбудителя и ее связывание с особыми молекулами - праймерами. Они специфичны для определенных участков ДНК, поэтому связываются с конкретными последовательностями нуклеотидов. Далее в дело вступает знакомая нам ДНК-полимераза и начинает интенсивно по принципу комплементарности синтезировать все новые и новые молекулы. Так как каждый раз из одной молекулы ДНК появляются две, то их количество растет в геометрической прогрессии (2, 4, 8, 16, 31, 64, 128 и т.д.), то есть за каждую последующую единицу времени образуется в два раза больше молекул, чем в предыдущую. Такой механизм позволяет за кратчайшие сроки получить очень большое количество генетического материала, что позволяет судить о том, присутствовал ли возбудитель в исследуемом материале или нет.
Для того, чтобы процесс шел эффективнее и быстрее, раствор подогревают до 94-96 градусов по Цельсию. Человеческие ферменты не способны функционировать при такой температуре, поэтому в ходе ПЦР используется ДНК-полимераза от особых бактерий - термофилов. Эти микроорганизмы обитают в гейзерах и горячих источниках, поэтому подобная температура наоборот является оптимальной для работы их ферментов.
ПЦР используется не только в медицине. Такой простой способ накопления генетического материала широко используется в криминалистике. Например, нападающий оставил на месте преступления каплю своей крови, и если у полиции есть подозреваемый, то они могут сравнить гены в этой капле крови и гены подозреваемого, и в случае совпадения - результат очевиден. Также ПЦР можно используется для установления отцовства, чтобы накопить большое количество ДНК отца и сына и в последующем сравнить их.
Полимеразная цепная реакция обладает высокой чувствительностью, и даже при наличии в материале всего одной бактерии, может показать ее присутствие, поэтому такая диагностика особо эффективна в нестандартных ситуациях, когда другие дополнительные методы обследования могут давать сомнительные результаты.