1492 год, Испания, Андалусия. Во время войны в Гранаде Агилар де Нерха проходит посвящение в братство ассасинов, где ему отрезают безымянный палец и выдают скрытые клинки. Он назначен защищать принца Ахмеда, сына эмира Гранады от тамплиеров.
Нижняя Калифорния, 1986 год. Маленький Каллум Линч возвращается домой и видит свою мать убитой. Её убил отец Каллума, Джозеф Линч, который состоит в ордене ассасинов. Тот убеждает сына убежать, потому что их выследили современные тамплиеры во главе с Аланом, генеральным директором компании «Абстерго», которая на самом деле является организацией древнего ордена. После убийства Кэл возненавидел своего отца. Спустя 30 лет, в 2016 году, Каллум Линч приговаривается к смертной казни за убийство сутенёра. Приговор приводится в исполнение. Однако казнь была постановкой «Абстерго» — Каллум просыпается в отделении компании в Мадриде. Рядом с собой он обнаруживает девушку по имени София Риккин, дочь главы «Абстерго», которая является главным учёным. Она рассказывает Линчу, что тамплиерам необходимо найти артефакт — «Яблоко Эдема». Оно нужно, чтобы искоренить человеческое насилие. Для его поисков Каллуму придётся погрузиться в Анимус — машину для считывания генетической памяти, с помощью которой можно переживать жизнь своих предков.
Каллум погружается в Анимус и переносится в 1492 год, в Испанию. Испанские инквизиторы, руководимые тамплиерами, распространили своё влияние почти на всю страну. Последний оплот сопротивления — Гранада. Агилар и его напарница Мария должны спасти принца Ахмеда, которого похитили тамплиеры во главе с великим магистром Томасом де Торквемадой. Их цель — заставить эмира Гранады, султана Мухаммеда XII, обменять «Яблоко Эдема» на своего сына. Агилар и Мария перехватывают тамплиеров, но проигрывают бой. Их захватывает Охеда, соратник Торквемады. Кэл выходит из Анимуса.
В современности Каллум встречает других ассасинов, удерживаемых в плену в организации. Большинство из них с подозрением относятся к Линчу, за исключением Муссы, потомка гаитянского ассасина 18-го века по имени Батист. Кэл начинает испытывать галлюцинации, называющиеся «эффектом просачивания» — он видит Агилара в современности. Во время сессий между Каллумом и Софией возникает взаимопонимание: она признаётся, что её мать тоже была убита ассасином. София, также как и Каллум, разделяет ненависть к братству ассасинов.
Кэл возвращается в Анимус. Агилар и Мария приговариваются к казни на костре. Им удаётся освободиться, но глава андалусских ассасинов, Бенедикто, погибает. Агилар и Мария совершают побег, и за ними устраивается погоня по крышам. В конце сеанса Агилар совершает «прыжок веры», что в свою очередь выводит Каллума из Анимуса и приводит к временной парализации. После восстановления, Кэл узнаёт, что его отец также находятся в этом здании. Алан Риккин объясняет Линчу, что, чтобы идти дальше, нужно оставить прошлое — убить своего отца. Кэл встречается с Джозефом и готовится совершить суд, однако тот объясняет сыну, что его мать тоже была ассасином. Она предпочла умереть от руки своего мужа, чтобы не попасться в руки тамплиеров. Линч-старший объясняет сыну, что тамплиеры не должны заполучить Яблоко Эдема, так как в нём скрыта некая сила, которая будет направлена против человечества; ассасины не должны позволить тамплиерам заполучить его. Каллум не убивает отца, однако говорит ему, что уничтожит орден ассасинов и, прежде всего, найдёт Яблоко. Между тем Алан Риккин испытывает давление со стороны старейшины ордена тамплиеров Эллен Кайе. Было принято решение закрыть организацию «Абстерго», а вместе с ним и проект «Анимус». По её словам, победа уже одержана.
После разговора с отцом Каллум добровольно подключается к Анимусу. Агилар и Мария устраивают засаду на Торквемаду, который с тамплиерами и принцем Ахмедом пришёл на встречу с Мухаммедом XII. Ассасинам удаётся убить многих тамплиеров. Агилар захватывает Торквемаду и забирает Яблоко. Но Охеда нападает на Марию и приставляет нож к её горлу, чтобы заставить Агилара сдаться. После того как Агилар убирает клинок от горла Торквемады, Охеда убивает Марию. После Агилар вступает с ним в бой и убивает его, а также забирает артефакт. Тамплиеры Торквемады пускаются в погоню за ассасином, но Агилар совершает ещё один «прыжок веры», что приводит к замыканию в Анимусе. События переносятся на определённое время, Агилар де Нерха передаёт Яблоко Эдема Христофору Колумбу, который обещает унести этот артефакт с собой в могилу. Таким образом тамплиеры узнают местоположение Яблока. В это время Мусса и другие ассасины устраивают беспорядки в «Абстерго».
Узнав об этом, Алан Риккин приказывает очистить объект, а сам вместе с Софией и начальником охраны Макгоуэном эвакуируется на вертолёте. Охранники убивают Джозефа. Во время их эвакуации Кэл всё ещё подключён к Анимусу. Он встречается с проекциями нескольких своих предков-ассасинов: матери, отца и Агилара. Мама убеждает Кэла в правоте ассасинов, и он принимает их кредо. Каллум присоединяется к другим ассасинам и даёт бой охранникам «Абстерго».
Тамплиеры находят Яблоко Эдема в церкви, где был погребён Колумб. После в Лондоне проходит церемония тамплиеров, на которой Алан Риккин сообщает о находке артефакта и о триумфе ордена. В это время Каллум, Мусса и ещё один выживший в бою ассасин Линь планируют пробраться в святилище. Внутри Кэл встречает Софию, которая разочарована в своём отце, так как он использовал свою дочь только чтобы найти артефакт. Она неохотно позволяет Линчу выполнить свою миссию. Каллум убивает Алана Риккина и крадёт Яблоко. Ассасины уходят с артефактом, а София обещает отомстить Каллуму.