Сэмюэл Л Джексон родился 21 декабря 1948 года в городе Вашингтон. Мать - Элизабет Джексон, работала на заводе. Отец жил вдали от семьи в Канзас-Сити, штат Миссури, а затем умер от алкоголизма. Джексон встречался с отцом всего два раза в жизни.
Детство провел в городе Чаттануга, штат Теннесси со своей матерью. Позже она попала в психиатрическую клинику, и его воспитывали бабушка с дедушкой и другие члены многочисленного семейства. Джексон учился в нескольких сегрегационных школах и окончил Riverside High School в Чаттануге. Между третьим и двенадцатым классом он играл на валторне и трубе в школьном оркестре.
Далее он поступил в частный мужской Morehouse College в Атланте на факультет архитектуры. С детства Сэмюэл боролся с заиканием. Он посещал врача колледжа, а также брал уроки учителя музыки. За старания Джексона перевели на факультет драмы. Там он создал театр «Just Us Theater», состоящий преимущественно из чернокожих актёров, и работал там до окончания колледжа в 1972 году.
После убийства Мартина Лютера Кинга-младшего в 1968 году Джексон присутствовал на похоронах в Атланте в качестве одного из приставов. Затем прилетел в Мемфис, чтобы присоединиться к маршу протеста. В интервью журналу «Parade» Джексон признался: «Я был зол из-за убийства, но я не был шокирован. Я знал, что изменения неизбежны и могут быть различными — не сидячая забастовка, не мирное сосуществование».
В 1969 году Джексон и ряд других студентов удерживали членов правления Morehouse College на территории кампуса, требуя реформы учебного плана школы и управления. Они добились того, что совет решил поменять свою политику, но Джексон был обвинён и в конечном итоге осуждён за незаконное лишение свободы второй степени. Джексон не мог учится два года из-за его судимости и его действий.
Ему пришлось работать социальным работником в Лос-Анджелесе, пока он не был исключён из колледжа. Джексон решил вернуться в Атланту, где он встретился со Стокли Кармайклом, Хьюбертом Рэп Брауном, а также другими членами братства Чёрная Сила. Он решил участвовать в вооружённой борьбе, но мать его отправила в Лос-Анджелес после предупреждения ФБР.