Прошло пять лет с тех пор, как Питер Паркер осознал, что с большой силой приходит большая ответственность. Кажется, Питер научился жить несколькими жизнями: он хорошо учится,Нью-Йорк признал его героем, Питер даже намеревается сделать Мэри Джейн предложение руки и сердца.
Но его лучший друг Гарри Озборн по-прежнему считает, что именно Человек-Паук несёт ответственность за преждевременную кончину его отца. Гарри намеревается отомстить ему в образе Гоблина-Младшего. Создав костюм и глайдер, он решает напасть на Питера. В результате стычки на улицах Нью-Йорка, Гарри получает от Питера серьёзное ранение, которое приводит к потере памяти. Гарри помнит лишь то, что его отец мёртв. В то же самое время из Нью-Йоркской тюрьмы сбегает преступник Флинт Марко. Скрываясь от полиции, Флинт волею случая оказывается на испытательном полигоне института физики как раз в момент запуска экспериментального устройства, которое изменяет его ДНК, превращая в суперзлодея Песочного Человека. В полицейском участке Питеру и его тёте Мэй рассказывают, что Флинт Марко был настоящим убийцей дяди Бена, а Кэррадайн (бандит, ответственный за ограбление клуба, где в роковую ночь выступал Питер) был лишь сообщником.
Тем временем у Питера и Мэри Джейн начинаются проблемы. Последнюю увольняют из театра, а у Паркера на работе появляется конкурент — Эдди Брок . Вдобавок ко всему этому, Питера прилюдно целует Гвен Стейси , которую он спас во время крушения здания. Это будит в Мэри Джейн ревность и недоверие, и она уходит из ресторана как раз перед тем, как Питер собирался сделать ей предложение руки и сердца. Вдобавок ещё и Осборну-Младшему возвращается память. Он шантажирует Мэри Джейн, и та, в ответ на предложение Питера выйти за него замуж, говорит, что у неё есть другой. Гарри сообщает Питеру, что другой — это он.
И вот ночью, когда Питер лёг спать, таинственная чёрная слизь, которая прицепилась к мопеду Питера во время одной из поездок, окутала его. Очнулся он на стене здания и увидел, что был облачён в чёрный костюм. Он почувствовал в себе великую силу и сильное желание отомстить всем своим обидчикам.
Сперва Питер наведывается к Озборну и жестоко калечит его. Потом он едва не убивает Флинта Марко, выплеснув на него мощную струю воды. Далее он обнаруживает, что Эдди сделал снимки чёрного Человека-Паука и занял место фотографа в штате. Паркер унижает Брока, доказав, что его фото — подделка. Вдобавок, он злится на Мэри и идёт с Гвен в клуб, куда Мэри Джейн устроилась на работу. Там он показательно танцует с Гвен и, в ходе стычки с охраной, бьёт Мэри по лицу.
Осознав, что он натворил, Человек-Паук наведывается в церковь. Звон колокола раздражает симбиота , пробудившего в Паркере агрессию. Симбиот нападает на Эдди Брока, волею случая оказавшегося в той же церкви, дабы попросить у Господа смерти Питера, и поглощает его. Эдди становится Веномом . Он заключает союз с Песочным Человеком и похищает Мэри Джейн, чтобы использовать её, как приманку для Человека-паука.
Человек-паук понимает, что не справится с Песочным Человеком и Веномом в одиночку, и просит Гарри о помощи. Но тот, демонстрируя последствия их последней стычки (шрамы на лице), его прогоняет. И тут выясняется, что дворецкий Бернард всё это время знал, что Норман Озборн случайно убил себя сам собственным глайдером. В итоге, после некоторых колебаний Гарри приходит на помощь другу, когда тот был уже на грани гибели. Вместе они побеждают Песочного Человека, и спасают Мэри Джейн от гибели, а затем Человек-Паук побеждает Венома, используя титановые трубы, а затем взорвав его бомбой Гарри. Но при этом Веном убивает последнего, который ценой своей жизни спас жизнь Питеру. Песочный Человек объясняет Питеру, что убил дядю Бена случайно, и не хотел этого. Питер его прощает, после чего Флинт уходит, растворившись на ветру вихрем песчинок. Завершают кино-комикс похороны Гарри, и молчаливый танец Питера с Мэри Джейн, крепко обнимающих друг друга.