По данным ВОЗ в 2019 году смертность от кишечных инфекций в мире существенно снизилась с 2,6 млн случаев в 2000 г. до 1,5 млн случаев в 2019 г., однако по-прежнему смертность от кишечных инфекций относится к 10 основным причинам смертей в мире.
Небезопасные продукты питания, содержащие болезнетворные бактерии, вирусы, паразитов или вредные химические вещества, являются причиной более 200 заболеваний – от диареи до онкологических заболеваний. По оценкам ВОЗ, от последствий употребления пищевых продуктов, загрязненных микроорганизмами или химическими веществами, ежегодно заболевают 600 миллионов человек, то есть почти каждый 10-й житель планеты, и умирают 420 000 человек, причем дети и бедные слои населения подвержены этому больше всех. Исследования ВОЗ по оценке болезней пищевого происхождения показали, что даже в благополучных странах цифры отравления очень большие: более 23 млн людей каждый год заболевают из-за потребления небезопасных пищевых продуктов, летальными исходами заканчиваются 5000 случаев (это 0,02%). Первое место среди факторов отравления занимают норовирусные инфекции (15 млн случаев); второе место - кампилобактериоз, (5 млн случаев из 23); третье место – токсоплазмоз (более 1 млн случаев); четвертое место-листериоз (0,4 млн случаев).
В настоящий момент для диагностики микроорганизмов разработан ряд методик, позволяющих выявлять нуклеиновые кислоты, входящие в состав микроорганизмов. Разнообразные инновационные подходы продолжают разрабатывать и сейчас.
Существует ряд разработанных документов для выявления патогенов в пищевых продуктах:
-ГОСТ 30726—2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coll»;
-ГОСТ Р 51921—2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes»;
-МУК 4.2.2321—08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах»;
-МУК 4,2.2428—08 «Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста»;
-МУК 4.2.992—00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157: Н7»;
-МУК 4.2.2872— 11Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Из множества методов можно выделить самые распространенные: полимеразная цепная реакция (ПЦР), полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, метод генетических зондов, сэндвич-гибридизация, биологические микрочипы, Масс-спектрометрия (MALDI TOF) матричная время-пролетная мaсс-спектрометрия, различные виды секвенирования.
Среди всех методик идентификации микроорганизмов наибольшее распространение получили методы, основанные на анализе структуры ДНК. Прогресс в освоении методов ДНК-диагностики послужил стимулом для разработки и внедрения в практику высокочувствительных методик оценки качества и экспертизы продуктов питания, основанных на методе ПЦР.
1) Методы на основе полимеразной цепной реакции
Методы выявления патогенных микроорганизмов на ПЦР являются альтернативными бактериологическому посеву и предусматривают ускоренное определение наличия или отсутствия ДНК бактерий родов Salmonella, Shigella, Cronobacter (Enterobacter sakazakii), энтерогеморрагических Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. видов C.jejuni, C. coli, C. lari, Listeria monocytogenes в определенном образце пищевого продукта, подвергнутого инкубации в жидких селективных питательных средах. Инкубация образца на питательной среде обязательна для анализа пищевых продуктов. Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям.
В основе метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией лежит амплификация фрагментов ДНК, ферментом полимеразой в присутствии синтетических праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Гибридизация флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастанием флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени —лабораторный метод, основанный на методе ПЦР, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий. Количество ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток:зондов или интеркаляторов. Оценка может быть количественной (измерение количества копий матрицы) и относительной (измерение относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов).
Метод ПЦР является высокочувствительным и позволяет обнаружить в образце одиночные молекулы нуклеиновых кислот микроорганизма за достаточно короткое время.
2) Метод генетических зондов
Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты в любых материалах. Он основан на способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот соединяться в двухцепочечные, если они взаимно комплементарны.
Метод заключается во взаимодействии меченого одноцепочечного фрагмента ДНК-зонда с денатурированной одноцепочечной ДНК при 55 градусах, образовании двухцепочечной молекулы в случае успешного взаимодействия и удалении молекул, которые не соединены с зондом. Таким образом, после реакции получают двухцепочечные молекулы ДНК, которые и указывают на наличие патогена.
Метод является высокочувствительным, специфичным, универсальным и нет необходимости в математической обработке результатов, но при этом трудность в получении ДНК-зонда и трудоемкость реакции.
3) Биологические микрочипы
Биологический микрочипы представляют матрицу ячеек, каждая из которых содержит специфичный зонд (молекула ДНК, белок, гликан, низкомолекулярный лиганд и т.д.), распознающий определенную мишень в анализируемом образце. Предварительно обработанные и помеченные флуоресцентным красителем молекулы анализируемого образца, введенного в камеру биочипа, способны проникать внутрь ячеек и взаимодействовать со специфичными зондами. При облучении светом определенной длины волны поверхности биочипа ячейки, в которых произошло специфичное взаимодействие, флуоресцируют.
История биочипов начиналась с анализа последовательностей ДНК. Одновременно проводимые в каждой ячейке реакции взаимодействия анализируемых молекул ДНК с иммобилизованными ДНК-зондами обеспечивают параллельную идентификацию множества геномных мишеней. Это позволяет использовать ДНК-биочипы в качестве эффективного молекулярного инструмента выявления клинически значимых маркеров возбудителей и причин социально значимых заболеваний, мониторинга пищевых продуктов, растительного сырья, возможных агро- и природных биоценозов .
4) Масс-спектрометрия (MALDI TOF) матричная время-пролетная мaсс-спектрометрия
Одной из самых перспективных технологий таксономической идентификации микроорганизмов является масс-спектрометрическое исследование.
Масс-спектрометрия является аналитической операцией, направленной на измерение и регистрацию отношения массы заряженных ионов к их заряду. Полученный результат представляет собой спектр, который отражает наличие и количество отношений молекулярной массы ионов веществ к их зарядам (m/z).
Метод основан на матрично-активированной лазерной ионизации (от английского: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) с времяпролетным разделением (от английского: Time of Flight, TОF) ионов (MALDI-TОF MS). Этот метод необходим для идентификации микроорганизмов и позволяет ионизировать биологические молекулы (пептиды, белки, ДНК, олигонуклеотиды, липополисахариды и др.) в присутствии матрицы под воздействием лазера. Полученные ионы разделяются во времяпролетном анализаторе за счет разной скорости перемещения, обратно пропорциональной массе иона. На основании информации о пути перемещения иона от источника ионизации до детектора, а также о времени этого перемещения, вычисляется скорость движения иона и отношение массы к заряду (m/z) для каждого иона.
Необходимость внедрения данного метода определяется его высокой эффективностью, быстротой получения результатов идентификации и простотой выполнения процедуры.
5) Секвенирование
Существует разнообразие видов секвенирования. Современные методы расшифровки ДНК можно условно разделить на три основных вида:
-классические – секвенирование с помощью капиллярного электрофореза и пиросеквенирование;
-новые («второго» поколения – Next Generation Sequencing – NGS) – способны расшифровать одновременно секвенирование миллионов фрагментов ДНК – это высокопроизводительное пиросеквенирование, циклическое лигазное и полупроводниковое секвенирование, секвенирование на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченых предшественников;
-новейшие («третьего» поколения – Next-Next Generation Sequencing – NNGS) методы секвенирования, которые считывают информацию с миллионов единичных фрагментов ДНК без их предварительного клонирования.
Наиболее распространенным по использованию является секвенирование «второго» поколения– NGS, которое способно обеспечивать массовое параллельное секвенирование гетерогенных фрагментов ДНК. NGS обеспечивает идентификацию микробных сообществ, что является достаточно перспективным для детального анализа микробиологического качества пищи.
Общие этапы методов секвенирования нового поколения включают в себя: получение библиотек (небольшие фрагменты ДНК в составе адаптерных нуклеотидных последовательностей для закрепления на носителе); отжиг специфических праймеров для секвенирования; иммобилизация полученных библиотек на микросферах или поверхности проточной ячейки с амплификацией с помощью эмульсионной или мостиковой PCR; гибридизация специфических праймеров с адаптерными участками; секвенирование. При этом методе прочтение последовательности связано с достройкой комплементарной цепи, что сопровождается испусканием сигнала. Сигнал регистрируется прибором, который переводит его в последовательность нуклеотидов.
Достоинства NGS: за один прогон возможно прочитать сразу несколько участков генома, позволяют сравнивать сообщества по филогенетическому сходству, но имеют и недостатки, такие как необходимость проводить вычислительный анализ, полученные данные сложно хранить и обрабатывать.
Основными группами патогенов, представляющих наибольшую опасность для человека, как известно, являются бактерии и вирусы. Другие патогены, такие как грибы или протисты, не менее опасны, но обычно для них не проводят генетический анализ для идентификации.
Сейчас активно продолжают развиваться совершенно новые технологии определения последовательностей ДНК, более того, существует возможность оценивать экспрессию тысяч генов, а также анализировать регуляцию их активности. Новые методы секвенирования активно используются в пищевой микробиологии за счет высокопроизводительных технологий, таких как микробиологическое профилирование на основе 16S рРНК, которое используется для исследования состава микробиоты различных пищевых продуктов.
Загрязнение продуктов питания и сырья для пищевой промышленности при транспортировке, обработке или хранении патогенными для человека микроорганизмами (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica и др.), часто приводит к тяжелым отравлениям и заболеваниям желудочно-кишечного тракта. Существуют продукты, которые наиболее подвержены обсеменение, например, такие как молоко и молочные продукты. Они характеризуются малым сроком годности, так как являются одной из хороших сред для развития широкого спектра патогенных микроорганизмов.
Отравление продуктами, контаминированными стафилококком является одним из самых распространённых во всем мире, а также обычно его связывают именно с употреблением молочных продуктов. Один нанограмм токсина, выделяемого стафилококком на один грамм пищи способен вызывать симптомы пищевого отравления. Обнаружение загрязнения пищевых продуктов и сырья, из которого их получают имеет важное социальное значение.
В Эфиопии, в регионе Тиграй, который является неблагополучным по распространению S. aureus, в 2016 году провели исследование распределения генов энтеротоксинов стафилококка при помощи секвенирования гена белка А (spa) в сыром коровьем молоке и молочных продуктах. По результатам исследования из 549 образцов 160 были положительными, что составило 29,1 % от общего числа исследуемых образцов.
Другое исследование было проведено в Пакистане, где загрязнение продуктов питания является повсеместной проблемой. Оно было направлено на получение культуры загрязняющих бактерий из местного переработанного масла, которое является основным продуктом молочной промышленности в стране. В результате был выделен и определен (путем секвенирования последовательностей 16S и 23S рРНК генов) штамм Enterococcusfaecium из образца сливочного масла.
В целом загрязнение микроорганизмами можно рассматривать с двух сторон. С одной стороны контаминация патогенными микроорганизмами является существенной проблемой для здоровья населения и с другой стороны патогенная флора также способна вызывать и технологические пороки пищевых продуктов (ухудшение вкуса, запаха, текстуры). В связи с глобализацией торговли продуктами питания важной задачей производителей становится продление срока хранения продуктов. Споры и термофильные бактерии способны вызывать порчу продуктов питания и создают проблемы, связанные с безопасностью продукта. Знание состава микробиома пищи и сырья для ее изготовления имеет большое значение для определения безопасности и качества пищевого продукта.