Развитие ЭКО произвело революцию в лечении бесплодия (Steptoe and Edwards, 1978). Тем не менее, частота оплодотворения с помощью ЭКО оставалась низкой при нарушении параметров семенной жидкости (Tournaye et al., 1992), и для преодоления проникновения клеток кумулюса, связывания блестящей оболочки и слияния оолеммы и мембраны сперматозоида необходимо было разработать методы микроманипуляций. Хотя Ланцендорф и соавт. (1988) добились первого нормального оплодотворения после инъекции одного сперматозоида в ооцит человека, и только после того, как первая беременность была достигнута после интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) (Palermo et al., 1992), ИКСИ стала процедурой, которая широко используется в клинической практике, что приводит к миллионам беременностей во всем мире. Хотя ИКСИ приводит к оплодотворению в 70-80% случаев, полная неудача оплодотворения происходит примерно в 1-3% циклов (Liu et al., 1995). Предыдущие исследования показали, что 83% неоплодотворенных ооцитов, подвергшихся микроинъекции, содержали сперматозоиды (Flaherty et al., 1998); однако основной причиной неудачного оплодотворения после ИКСИ, по-видимому, является отсутствие активации ооцитов. Это предположение подтвердилось позже, когда иммунофлуоресцентный анализ неоплодотворенных ооцитов показал, что основной причиной неоплодотворения является сбой активации ооцита, за которым следуют дефекты аппозиции пронуклеусов, остановка в метафазной пластинке первого митотического деления зародыша, нарушение проникновения сперматозоидов фрагментация ДНК ооцитов и сперматозоидов (Rawe et al., 2000). Оплодотворение — сложный многоступенчатый молекулярный процесс, необходимый для создания диплоидной (2n) зиготы. Среди множества изменений, которым должен подвергнуться ооцит для того, чтобы произошло оплодотворение, увеличение цитоплазматического Ca2+ при оплодотворении считается универсальным требованием для активации ооцита (Ducibella and Fissore, 2008). Это увеличение запускает повторяющиеся колебания из запасов Ca2+ в эндоплазматическом ретикулуме, что снижает активность фактора, способствующего метафазе, и цитостатического фактора, позволяя ооциту восстановить мейотическую способность (Balakier et al., 2002). Осцилляции Са2+ стимулируются проникновением сперматозоидов, которые распространяют растворимый в сперме фактор, который гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат до инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерина. После этого инозитол-1,4,5-трифосфат связывается со специфическими рецепторами, которые индуцируют дальнейшие колебания Ca2+, что приводит к активации ооцитов (Machaty, 2016; Kubiak and Kloc, 2017).
Было проведено несколько клинических исследований естественных стимуляторов ооцитов, таких как фосфолипаза C-дзета (PLCζ), и искусственных стимуляторов ооцитов, таких как ионофор кальция (Ca.I) A23187, иономицин, хлорид стронция или даже электрические импульсы для преодоления дефицита активации ооцитов ( Анифандис и др., 2019). Ca.I A23187 может повышать концентрацию в плазме путем перекачивания внеклеточного Ca2+ против градиента концентрации и, в конечном итоге, активации ооцита (Ducibella and Fissore, 2008). Результаты исследований с применением Ca.I. A23187 сразу после ИКСИ для улучшения показателей оплодотворения противоречивы (Chi et al., 2004; Murase et al., 2004; Borges et al., 2009; Ebner et al., 2012; Vanden Meerschaut et al., 2012; Caglar Aytac et al. и др., 2015; Ким и др., 2015). Способен ли Ca.I A23187 активировать неоплодотворенные ооциты на следующий день после ИКСИ, заслуживает дальнейшего изучения, чтобы помочь пациентам, столкнувшимся с низким или полным отсутствием оплодотворения
Цель исследования: изучение влияния Ca.I A23187 на активацию и последующее эмбриональное развитие однодневных неоплодотворенных ооцитов человека после ИКСИ.
Группа: Исследуемая группа состояла из 24 пациенток, перенесших цикл ЭКО и ИКСИ, у которых извлечение ооцитов было проведено в период с октября по ноябрь 2020 года. Критериями включения в исследуемую группу были использование ИКСИ с нативной спермой, наличие как минимум двух неоплодотворенных ооцитов на следующий день после ИКСИ
Всего у 24 пациенток, участвовавших в исследовании, было получено 465 ооцитов, из которых 344 были зрелыми (метафаза II).
Через восемнадцать часов после ИКСИ 256 из 344 микроинъецированных ооцитов демонстрировали два пронуклеуса и два полярных тельца и считались оплодотворенными зиготами (74,4%).
Семьдесят ооцитов, у которых не было признаков оплодотворения и признаков дегенерации (нормальная морфология с однородной текстурой и чистой цитоплазмой), были включены в это исследование и отнесены или к группе активации ионофора Ca 2+ или к контрольной группе. Тридцать пять неоплодотворенных ооцитов были случайным образом отнесены к группе активации ионофора, тогда как остальные 35 были отнесены к контрольной группе.
В исследуемой группе были активированы четыре из 35 ооцитов (11,4%), из которых два показали один пронуклеус (1PN) и два полярных тельца (2PB) и два показали два пронуклеуса (2PN) и 2PB. В контрольной группе признаки оплодотворения появились у шесть из 35 ооцитов (17,1%), из которых один показал 1PN/2PN, четыре — 2PN/2PB и один — более 2PN.
Эмбрионы далее культивировали в течение 5 дней после появления пронуклеусов, после дробления или того и другого. Скорость расщепления была одинаковой в обеих группах (45,7%).
Результат
В группе обработки ионофором пять эмбрионов развились до двух-четырехклеточной стадии, девять — до пяти-восьмиклеточной стадии и два — до более чем восьмиклеточной стадии. В контрольной группе семь развились до двух-четырехклеточной стадии, четыре - до пяти-восьмиклеточной стадии и пять показали более восьми клеток. Анализ дня расщепления показал, что 18,8% произошло на Д+2 в группе ионофора, 37,5% на Д+3 и 43,8% на Д+4 культуры, тогда как в контрольной группе расщепление наблюдалось на Д+ 2 (43,8%), Д+3 (43,8%) и Д+4 (12,5%) соответственно. Ни один из культивируемых эмбрионов ни в одной из групп не смог достичь стадии бластоцисты. Статистических различий не наблюдалось (ТАБЛИЦА 2) ни в одной из скоростей при сравнении ионофора с контрольной группой.
Обсуждение:
В настоящем исследовании обнаружено, что активация и дробление могут происходить в ооцитах без признаков оплодотворения через 18 ч после ИКСИ, независимо от воздействия Ca.I A23187. К сожалению, полученные эмбрионы останавливаются до достижения стадии бластоцисты.
Низкий уровень оплодотворения или отсутствие оплодотворения является разочаровывающим опытом для бесплодной пары, проходящей лечение от бесплодия, а так же и для специалистов репродуктивного центра, которых они посещают. Кроме того, даже у пациентов с нормальным уровнем оплодотворения может быть полезно иметь большую когорту эмбрионов для культивирования in vitro, чтобы улучшить возможности отбора во время переноса. В некоторых клиниках спасательная ИКСИ проводится на однодневных неудачно оплодотворенных ооцитах после обычного ЭКО (Nagy et al., 1993) без единого мнения о том, стоит ли пытаться, поскольку имеющиеся ограниченные данные неубедительны (Beck-Fruchter et al. ., 2014). Принято считать, что увеличение содержания кальция играет ключевую роль в запуске всех последующих ядерных и цитоплазматических изменений в оплодотворенных ооцитах, ведущих к успешной активации ооцитов и инициации эмбриогенеза (Miyazaki and Ito, 2006). Следовательно, методы искусственной активации ооцитов направлены на воспроизведение этого путем искусственного повышения уровня кальция после микроинъекции спермы, и их клиническое использование было предложено уже в начале эры ИКСИ (Tesarik et al., 1995). С тех пор был проведен ряд исследований по оценке ценности кальциевых ионофоров как метода активации ооцитов у человека, но консенсуса достигнуто не было (Chi et al., 2004; Murase et al., 2004; Borges et al., 2009). ; Ebner et al., 2012; Vanden Meerschaut et al., 2012; Caglar Aytac et al., 2015; Kim et al., 2015). Одной из причин отсутствия согласия могут быть разные протоколы, которым следуют при проведении экспериментов. Недавнее исследование показало, что применение двойного ионофора может улучшить образование бластоцист и частоту наступления клинической беременности в случаях неудачного лечения одним ионофором (Shebl et al., 2021).
Однако вопрос о том, может ли активация искусственных ооцитов увеличить риск врожденных дефектов, остается спорным. Недавний анализ показал, что активация ооцитов не представляет существенной разницы в распространенности основных врожденных дефектов или типов врожденных дефектов (хромосомные аберрации и нехромосомные аберрации) по сравнению с обычной ИКСИ (Long et al., 2020).
В настоящем исследовании авторы стремились оценить, возможна ли активация ооцитов через 18 часов после неудачной ИКСИ. По их мнению, это первое исследование, в котором неоплодотворенные ооциты человека D+1 подвергаются воздействию Ca.I A23187 и проспективно сравниваются его эффекты с контрольной группой ооцитов этой же когорты, где такого воздействия не было.
Когда ооцит млекопитающих активируется, первым наблюдаемым цитоплазматическим событием является увеличение концентрации внутриклеточного кальция (Balakier et al., 2002). Первоначальное увеличение содержания Ca2+ начинается в течение нескольких минут после слияния сперматозоидов и ооцитов при ЭКО, после чего следует типичный паттерн кальциевых колебаний, которые имеют решающее значение для нормального оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона (Ducibella et al., 2002). В настоящем исследовании результаты, обнаруженные в ооцитах, подвергшихся искусственной активации, могут быть объяснены тем фактом, что ионофоры Ca+2 не способны производить необходимые колебания Ca+2 (Tesarik and Testart, 1994). Ограничивающим фактором настоящего исследования является то, что выборка включала преимущественно женский фактор бесплодия. Существующие данные об использовании ионофоров Ca+2 позволяют предположить, что их применение сразу после ИКСИ может улучшить исходы у пациенток с повторными неудачами оплодотворения (Chi et al., 2004; Murase et al., 2004; Kim et al., 2015) или тяжелый мужской фактор бесплодия (Ebner et al., 2012). Однако улучшения не наблюдалось у пациенток со сниженным овариальным резервом (Caglar Aytac et al., 2015) или дефицитом активации, связанным с ооцитами (Vanden Meerschaut et al., 2012).
Наше исследование подтверждает небольшую и обескураживающую информацию, опубликованную о применимости Ca.I A23187 в неоплодотворенных ооцитах. В трех доступных исследованиях отсутствует контрольная группа без воздействия упомянутого ионофора, но все согласны с тем, что полученные эмбрионы имеют плохое эмбриональное развитие, поскольку частота пригодных для использования бластоцист колеблется от 2,6 до 5,2% (Liu et al., 2014; Economou et al., 2017b; Сюй и др., 2021). Кроме того, когда был оценен статус эуплоидии бластоцисты, они обнаружили, что все они были хромосомными аномалиями (Economou et al., 2017a).
Настоящий проект имеет некоторые потенциальные ограничения,
- небольшое количество неоплодотворенных ооцитов, которые изучались.
- культивировали неоплодотворенные ооциты не в системе замедленного мониторинга (time laps), поэтому могли пропустить некоторые проявления пронуклеусов.
- не смогли оценивали эуплоидный статус эмбрионов, поскольку ни один из них не достиг стадии бластоцисты.
Основными преимуществами являются
- перспективный дизайн
- ооциты от одного и того же пациента были случайным образом разделены на экспериментальную и контрольную группы, что делает исследуемые группы сопоставимыми.
В заключение, необходимы дополнительные исследования, чтобы найти эффективный и безопасный метод преодоления неудачи ИКСИ, поскольку неоплодотворенные ооциты обычно удаляются, когда происходит этот сценарий, и единственным решением на сегодняшний день является повторная попытка ИКСИ.
В недавней публикации говорится, что двойное применение ионофора может улучшить показатели образования бластоцист и клинической беременности в случаях неудачного однократного применения (Shebl et al., 2021), предполагая, что результаты применения Ca.I A23187 могут быть улучшены. С другой стороны, все больше данных указывает на то, что PLCζ является ключевым белком спермы, ответственным за активацию ооцита (Dai et al., 2020). Обнадеживающие результаты, полученные после микроинъекции рекомбинантной спермы PLCζ (фосфолипаза C дзета: 1 фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат фосфодиэстераза дзета-1) в ооциты мыши (Nomikos et al., 2013), должны быть подтверждены в ооцитах человека