Введение:
У женщин рост и созревание фолликула от примордиального до преовуляторного занимает около полугода. В течение этого процесса ооцит вырастает с 35 мкм до 100-150 мкм, диаметр преовуляторного ооцита достигает 100-120 мкм. Тем не менее мейотическое деление происходит только к моменту овуляции, когда ооцит реагирует на выброс гонадотропинов (преовуляторный пик ЛГ), проходя стадии от GV (germinal vesicle, стадия зародышевого пузырька) до стадии метафазы второго мейотического деления MII (зрелый ооцит), что характеризуется окончательным дозреванием ядра и цитоплазмы, включая перераспределение органелл для дальнейшего развития.
ВРТ у млекопитающих, исключая человека, происходят по общему принципу путем забора незрелого ооцита, который далее претерпевает дозревание в специальной среде до стадии МII(IVM in vitro maturation), далее происходит стандартное ЭКО. Интересно, что для каждого вида животных (в частности, собак, крыс, резус-макак, коз, мышей) существует свой минимальный диаметр ооцита, позволяющий «дозреть» посредством технологии IVM. Что касается человека, лишь небольшой процент исследователей изучают вопрос: существует ли нижний порог диаметра ооцита, способный дать «дозреть» ооциту и есть ли связь между увеличенным диаметром ооцита и способности к созреванию ядерно-цитоплазматического соотношения.
Durinzi et al. были первыми из ученых, кто сообщил, что запуск мейотического деления ооцитов, полученных из нестимулированных яичников, зависит от диаметра ооцита. Это было впоследствии подтверждено на пациентках с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) с/без стимуляции, а также при стимуляции яичников с последующей процедурой интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ). В исследовании также предполагалось, что увеличенный диаметр ооцита на стадии GV связан со сниженной способностью к транскрипции и повышенным потенциалом к дозреванию.
В настоящем исследовании изучалось большое количество ооцитов из ткани яичников, далее криоконсервированных с целью сохранения фертильности; дозревание ооцитов происходило в среде с помощью методики IVM.
Цель исследования: влияет ли диаметр ооцита и комплекса ооцит-кумулюс (ОКК), полученных из не стимулированных яичников, на количество зрелых ооцитов MII, используя IVM метод.
Материалы и методы:
В исследовании приняли участие 75 пациентов. Яичники были криоконсервированы в Laboratory of Reproductive Biology, University Hospital of Copenhagen, Denmark. Ни одна из пациенток не получала гормональную стимуляцию. Ткань яичника исследовали на наличие ооцит-кумюлусного комплекса, высвобождаемого из мелких антральных фолликулов диаметром до 3-х мм.
Классификация ОКК:
По размерам кумулюса, окружающего незрелый ооцит, клетки распределены на группы:
- «голый» ооцит, лишенный кумулюса
- небольшие ОКК, состоящие из 3-10 слоев клеток, окружающих ооцит
- крупные ОКК, более 10 слоев клеток
Измерение диаметра ооцита:
Диаметр ооцита был получен путем среднего значения двух измерений в перпендикулярных плоскостях до блестящей оболочки, последняя не включалась в измерение.
Статистический анализ:
Для оценки использовалась модель смешанной логистической регрессия, используя следующие характеристики: частота созревания ооцита до МII (да/нет), размер ОКК («голый» ооцит, небольшой ОКК, крупный ОКК), диагноз (рак молочной железы (РМЖ)/любое другое заболевание), возраст пациентки, вес яичника, диаметр ооцита. Выбор пациентки – рандомный.
Результаты:
Характеристика пациентов: Среди исследуемых РМЖ (n = 33), гематологический рак (n = 11), рак ЖКТ (n = 7), рак ЦНС (n = 5), остеосаркома и саркома (n = 5), гинекологический рак (n = 2), доброкачественная опухоль (n = 6), другие (n = 6). Средний возраст 26,7 лет (диапазон: 14-40,9 лет), вес яичников 8,2 гр (SD: 0.09, диапазон: 2.4–19.8 гр.), объем яичников 8.2 мл.
Характеристика ооцитов и ОКК:
Было получено 1563 ооцитов. После IVM489 (31%) ооцитов достигли MII, 307 (20%)MI и 469 (30%) GV и 298 (19%) дегенерировали.
Из 1563 ооцитов 618 (40%) крупные ОКК, 597 (38%) небольшие ОКК и 348 (22%) «голые» ооциты.
310 ОКК были измерены. Из крупных ОКК 149 имели диаметр 494мкм (диапазон 223.6–834.4 мкм), и 161 небольших ОКК имели диаметр 249 мкм (диапазон 161-536 мкм). Диаметр крупных ОКК был значительно выше, чем диаметр небольших ОКК (p <0.002).
Диаметр ооцитов и стадия зрелости:
Колебания диаметра ооцитов были от 60 до 171 мкм, среднее значение 115 мкм (стандартное отклонение: 12,1). Межквартильный размах был от 107 до 124 мкм, средний диаметр более 107 мкм у 75% ооцитов. Показана положительная корреляция диаметра ооцитов с более высокой частотой MII(p <0,001). Ооциты MII, MI, GV после IVM имели разный диаметр ооцита (p <0,0001), причем ооциты, достигшие стадии MII, имели больший диаметр по сравнению со стадиями MI и GV (таблица 1).
Диаметр ооцита и размер ОКК:
Обнаружена сильная связь между размером ОКК и MII стадией ооцита (p <0,001) и большим диаметром ооцита (p <0,001).
На рис.1 продемонстрирована связь между общим количеством ооцитов (А), «голых» ооцитов (В), небольших ОКК (С), крупных ОКК (D) (черные столбики), и количеством ооцитов, дозревших до MII (белые столбики). Вертикаль – количество ооцитов, горизонталь – диаметр ооцитов.
На рис.2 показана зависимость скорости созревания ооцитов от диаметра различных размеров ОКК.
Согласно модели: для ооцитов диаметром менее 100 мкм вероятность достижения MII составляет 5% (7 ооцитов MII из общего 138 ооцитов диаметром <100 мкм); для ооцитов с диаметром 145 мкм в небольших ОКК - 85%; для ооцитов диаметром 142 мкм в небольших ОКК - 88%; «голые» ооциты - 56%.
Диаметр ооцитов и характеристика пациентов:
Исследование не показало связи между диаметром ооцитов и возрастом пациентов (p=0.1) и весом яичников (p=0.3). Что касается связи с характером заболевания, доля женщин с диагнозом РМЖ была выше, однако никаких значительных различий в диаметре ооцитов и ОКК не было обнаружено.
Обсуждение.
- Исследование более чем на 1500 ооцитов продемонстрировало положительную связь между диаметром ооцитов и способности к дозреванию до стадии MII в течение 44-х часового периода. Кроме того, размер ОКК также важен для достижения ооцитом MII.
- Существует несоответствие между диаметром фолликула и диаметром ооцита. Диаметр ооцита у человека достигает конечного размера 110-120 мкм в относительно небольших фолликулах до 3-х мм и не увеличивается с ростом самого фолликула. Это удивительно, ведь общепринято, что из мелких фолликулов ооциты обладают плохой способностью к развитию и достижению стадии MII (Fair T. 2005, Fair T, Hyttel P, Greve T. Bovine, 1995).
- Важным фактором для дозревания ооцита являются клетки кумулюса, стимулируя рост которых, можно добиться более высокой эффективности IVM. В связи с этим, текущее исследование предполагает, что можно сосредоточиться на стимуляции клеток кумулюса для повышения скорости созревания ооцита.
- Ооциты, включенные в исследование, были получены из ткани яичника из мелких фолликулов диаметром до 3х мм и показано, что ооциты диаметром в среднем 123 мкм достигают стадии MII, а ооциты менее 100 мкм лишь в 5% случаев. Более ранние исследования указывали на конечный диаметр фолликула в 115 мкм, что очень близко к полученным в ходе настоящего исследования цифре конечного диаметра ооцита.
- Для моделирования роста и созревания ооцитов у человека часто используется модель животных, в частности крупного рогатого скота. Но она не отражает реальную картину процесса у человека, так как у животных частота дозревания ооцитов до стадии MIIзависит от диаметра фолликула, что нельзя сказать про человека.
- Частота атрезии мелких антральных фолликулов от 0,4 до 2,0мм составляет 15-24%. В больших фолликулах частота атрезии меньше, но «выживаемость» ооцитов не равна способности к дальнейшему развитию.
- Исследование LazzaroniTealdi et al. (2015 г.) указывало на связь диаметра ооцита и качества клетки, а, следовательно, и качество эмбриона, но в работе Romão et al. такой связи не отмечено. Более ранние работы также указывали на уменьшение диаметра ооцита с возрастом и повышенным ИМТ, но в текущей работе подтверждения связи диаметра ооцита с возрастом нет, а по ИМТ нет данных.
- Ограничение этой работы – отсутствие оплодотворения ооцитов, тем не менее работа представляет интерес в области исследования кумулюсных клеток, их стимуляции возможна необходима для повышения частоты дозревания ооцита до стадии MII и использования IVM в клинической практике. Кроме того, исследование еще раз подтверждает, что ооцит достигает своего конечного размера на стадии малых антральных фолликулов и что клетки, окружающие ооцит, играют ключевую роль в его развитии.