В предыдущих частях мы многое узнали, но остается вопрос: как это все делают? Не теоретически, а руками, как это происходит?
Давайте проясним некоторые моменты.
Итак, театр начинается с вешалки, а молекулярное клонирование с микробиологической лаборатории.
Лаборатория выглядит примерно как-то так, конечно, чаще всего, она не такая чистая, также кругом легкий беспорядок, но да, все примерно так и есть.
Но самая главная часть - это изолированный микробиологический бокс или ламинар. Это пространство, в котором проводятся все манипуляции с клетками. Ламинар стерильный, в нем нет загрязненного воздуха, нет пыли, это самое главное место в лаборатории.
Итак, у нас есть лаборатория, есть рабочее место, что дальше? Дальше нам нужны реагенты. Во-первых, необходимы эндонуклеазы рестрикции, их продают в готовом виде. Эндонуклеазы получают из микроорганизмов путем из измельчения с последующим выделением нужной эндонуклеазы рестрикции с помощью химических методов.
Во-вторых, нам нужны лигазы. Одна из самых популярных - лигаза фага Т4. Эту лигаза продуцируется клеткой при ее заражении фагом Т4 (название у него такое). Далее клетки разрушают и выделяют нужный нам энзим (лигазу фага Т4). Но, естественно, ее можно и купить, и, чаще всего, именно так и поступают.
В третьих, нужны плазмиды. Их также можно приобрести, например, плазмиды
Итак, теперь нам нужно "вырезать" определенный ген. Берем суспензию клеток бактерий, например, брага - это типичная суспензия клеток дрожжей. Подобным образом можно получить суспензию практически любых клеток.
Но чаще всего суспензия выглядит более консервативно.
Суспензия - это множество клеток, плавающих в воде, а ДНК у них внутри, нужно выделить эту ДНК в раствор, иначе она будет недоступна для действия эндонуклеаз рестрикции или лигаз. Для этого проводим разрушение клеток или лизис. Клетки при этом гибнут (RIP), а ДНК выделяется в раствор. Есть множество способов лизиса клеток, например, физические, химические или ферментативные. Мы на этом остановимся позже.
Итак, у нас есть ДНК, добавляем к ней рестриктазы, которые "разрежут" исходную молекулу в нужных местах. Просто сливаем два раствора и ждем. А вы что хотели? Подождали? Отлично, теперь добавляем рестриктазы к нашим плазмидам, там также будут внесены разрывы с образованием липких концов, т.е. опять же сливаем два раствора и ждем. Подождали? Отлично, сливаем растворы с нашей ДНК и раствор с плазмидами, немного еще ждем. При этом липкие концы вырезанного фрагмента "находят" липкие концы плазмиды и соединяются с ними. Затем наливаем в смесь лигазу. Она "зашивает" нашу рекомбинантную молекулу. Отлично, добавляем в смесь суспензию клеток, в которые мы хотим поместить рекомбинантную плазмиду. Далее обрабатываем все электрическим током, ждем еще немного и проводим тесты.
Зачем проводить тесты?
Как было сказано ранее, трансформация это вероятностный процесс, и мы должны убедиться, что она действительно произошла. Для этого клетки высевают на плотную питательную среду в чашке Петри, содержащую селективный маркер (антибиотик или какой-то специфический субстрат). Нужно учесть, что плазмида заранее несет в своем составе ген, ответственный за этот селективный признак.