Собор был построен в 1856—1879 годах (по другой версии, в 1851—1876 годах) по проекту академика Д. И. Гримма. Впоследствии храм неоднократно посещался российскими императорами, от Александра II до Николая II. После присоединения Бреста к Польше в XX веке собор был переделан в католический храм по проекту архитектора Юлиана Лисецкого, претерпев значительные изменения в области фасада. Во время Великой Отечественной войны храм сильно пострадал, и в 1972 году была произведена его консервация с включением в мемориальный комплекс «Брестская крепость-герой». Уже в 1991 году состоялось первое послевоенное богослужение, а в 1994 году храм вернули верующим. Началась его реставрация, завершившаяся лишь в 2005 году; до сих пор ведутся работы по внутренней отделке собора.
Собор представляет собой памятник русско-византийского стиля и является одним из наиболее ярких примеров заимствований из византийского зодчества.
Самой ценной святыней для собора остаётся икона с частичкой мощей храмового святого Николая Чудотворца.
В соборе хранятся также образы св. великомученика Пантелеимона с частичкой его мощей, св. блаженной Матроны Московской с частицей её мощей и св. преподобных Иова и Амфилохия Почаевских с частицами их мощей. Кроме частицы Животворящего Креста Господня, объектом почитания в соборе являются частицы мощей апостола Андрея Первозванного, Григория Чудотворца, Нифонта Цареградского, митрополита Тобольского и всея Сибири Иоанна, священномученика Кукши в Дальних пещерах, диакона Киево-Печерского священномученика Лукиана, священномученика Харлампия, 20 000 мучеников Никомидийских, мученика Александра, преп. Сергия Послушливого, преп. Дионисия Затворника Киево-Печерского, преп. Алипия, иконописца Киево-Печерского, преп. Пимена Постника Киево-Печерского, преп. Вениамина Киево-Печерского, преп. Исаакия Далматского, преподобной Евфросинии Полоцкой, преподобного Арсения Трудолюбивого, преподобного Акилы Диакона, преп. Моисея Чудотворца, святой Параскевы, святых-бессребреников Космы и Домиана
В летописи под 1596 годом храм упоминался как место, где была подписана Брестская церковная уния. Кстати, большинство белорусов не приняли ту унию, сохранив верность православию. В целом к началу XVIII века в старом Бресте было около 20 православных храмов, но Свято-Николаевский храм был одним из самых известных.
В 1833 году началось строительство легендарной Брестской крепости и старый город, а вместе с ним и храм снесли. Только лишь в 1851 году началось его восстановление. Святыню отстроили заново по проекту архитектора Давида Гримма на личные средства русских офицеров и духовенства местного гарнизона.
За белоснежные стены в народе этот храм прозвали «Белой церковью».
С 2009 года в храмовый комплекс входит и специально возведенный храм-часовня, в котором совершаются Таинства Крещения и Венчания. Сам храм частично восстанавливаетсяся.
И сегодня Свято-Николаевский гарнизонный храм снова выглядит, как и во времена царя Николая II. По своей структуре храм двухэтажный. Нижний этаж посвящен мученику Иоанну Воину, а верхний – святителю Николаю Чудотворцу.