В прошлый раз я рассказывала о Фридрихе Мишере - учёном, который впервые выделил вещество ядра клетки и назвал его нуклеином. В этот раз я расскажу, каким трудом ему это далось.
Технология и открытие Фридриха Мишера
Фридрих Мишер начал с изучения биохимического состава лейкоцитов, тогда считалось, что это «наиболее простой и независимый тип клеток» (ну нет, конечно).
Сначала он пытался выделить лейкоциты из лимфатических узлов (резво начал, конечно), но у него ничего не получилось.
Тогда он пошёл простым путём. Врачи хирургической клиники Тюбингена отдавали ему бинты с гнойным отделяемым. За несколько месяцев Мишер разработал свой первый метод исследования.
Первый протокол
Первое. Выделение лейкоцитов из гноя
- Осматривал материал, он не должен был быть загрязнённым или старым.
- Отделял лейкоциты от бинта и сыворотки крови. Для этого использовал раствор хлорида натрия (поваренной соли) или соли щелочноземельных металлов (магния, кальция, возможно, бария). Это приводило к «слизистому распуханию» клеток. Это явление было связано с выходом огромной ДНК из повреждённых клеток.
- Попробовал разбавленный раствор сульфата натрия, чтобы отмыть бинты. Получилось изолировать отдельные лейкоциты. Он профильтровал их через лист бумаги, чтобы убрать волокна бинтов. Разбавленный раствор сульфата натрия: 1 часть глауберовой соли (Na2SO4*10H2O) и 1 часть воды.
- Дал раствору отстояться на 1 — 2 часа, чтобы клетки осели.
- Проверил под микроскопом, что у лейкоцитов нет признаков повреждения.
Второе. Отделение ядра клетки от цитоплазмы
Промыл клетки 6 — 10 раз свежим раствором разбавленной (1:1000) соляной кислоты в течение нескольких недель при «зимней температуре». Это позволяло убрать большую часть клеточной «протоплазмы», то есть цитоплазмы.
Остатком были ядра с небольшими фрагментами цитоплазмы. Они больше не окрашивались в жёлтый цвет растворами йода (так в то время определяли наличие цитоплазмы).
Третье. Дальнейшая очистка
Энергично и долго встряхивал ядра в смеси воды и эфира. Липиды (жиры) растворялись в эфире, ядра с прикрепившейся цитоплазмой скапливались на границе фаз вода — эфир. Чистые ядра без остатков цитоплазмы оставались в водной фазе.
Четвёртое. Получение чистых ядер
Профильтровывал оставшиеся ядра и исследовал их под микроскопом. Так он получил «совершенно чистые ядра с ровным контуром, однородным содержимым, отчётливо видимыми ядрышками, несколько меньшими относительно исходного объёма».
Пятое. Выделение нуклеина
Мишер добавлял к ядрам сильно разбавленный раствор (1:100 000) карбоната натрия. Ядра сильно разбухали и становились прозрачными.
Выделил «жёлтый раствор вещества» из ядер. Добавляя уксусную или соляную кислоту в избытке, получил нерастворимый хлопьевидный осадок, это и была ДНК. Мишер заметил, что осадок может вновь раствориться, если к нему добавить щелочной раствор.
Этот алгоритм действий давал лишь небольшое количество материала, да и не совсем чистого. Тогда Фридрих Мишер разработал второй протокол, благодаря которому материала было больше и он был чище.
Второй протокол
Основной целью второго протокола было максимально возможное удаление белков, которые загрязняли чистый нуклеин.
«Я обратился к агенту, который уже использовался в химии для растворения альбумина, - растворам пепсина»
Пепсин - это фермент, который расщепляет белки. Мишер получал пепсин из желудков свиней.
- Отмывал лейкоциты 3 — 4 раза в «тёплом алкоголе», чтобы удалить липиды.
- Полученный остаток оставлял в растворе пепсина на 18 — 24 часа при температуре 37 — 45°С (температура тела млекопитающих, при которой пепсин активен). Через несколько часов от жёлтой жидкости отделялся серый тонкий поршкообразный осадок. Затем Мишер продолжал удаление белков, дважды меняя раствор пепсина. После этой процедуры образовался осадок из ядер без примеси белков цитоплазмы
- Несколько раз встряхивал осадок с эфиром, чтобы удалить оставшиеся липиды.
- Профильтровывал ядра и промывал их в воде, чтобы окончательно удалить любые следы белков.
- Ещё несколько раз промывал ядра в тёплом спирте. Мишер отметил, что очищенная таким образом «ядерная масса» имеет те же химические свойства, что и ядра, изолированные с помощью соляной кислоты.
В итоге Фридрих Мишер получил чистые ядра лейкоцитов, которые были хорошо видны под микроскопом.
Он определил, что осадок состоит из атомов углерода, водорода, кислорода, азота (14%). Но в нём нет серы (значит, это не белок) и много фосфора (2,5% или 6%, информация мне попадалась разная).
Впервые об этих экспериментах он сообщил родителям 21 августа 1869 года.
Тогда было известно лишь одно органическое вещество с богатым содержанием фосфора — фосфолипид лецитин. Но фосфор не удалялся горячим спиртом, значит, это не фосфолипид, а какое-то новое соединение.
Оно хорошо растворялось в щелочах, но не в разбавленных кислотах. Также оно окрашивалось основными (щелочными), красителями, то есть было базофильным. Скорее всего, имело кислотные свойства. Но всё это не было свойственно другим известным веществам биологического происхождения.
Фридрих Мишер писал Вильгельму Гису:
«В ходе моих экспериментов по изучению биохимического состава ядер лейкоцитов мною было получено вещество,
которое образует осадок с раствором щёлочи,
который не растворяется в воде, в уксусной кислоте и в солевом растворе, а также не относится к известным белкам, так как содержит большое количество фосфора».
«Основываясь на известных данных о гистохимии, могу предположить, что данное вещество может относиться к ядру».
Он предположил, что эта субстанция принадлежит новому классу органических веществ и назвал её «нуклеин» от латинского nucleus — ядро.
Фридрих Мишер понял, что нуклеин играет центральную роль в клетке. В письме Вильгельму Гису от 20 декабря 1869 года он высказал предположение, что количественное соотношение нуклеина к белкам клетке поможет лучше понять патологические процессы.
Также он полагал, что увеличение количества «ядерного вещества» - это предварительная фаза перед делением клетки в активно растущих тканях, например, в тканях опухолей. И во многом он был прав.