Чанджу Пак (Chang-Joo Park), Чжэхён Лим (Jae Hyung Lim), Марко Талларико (Marco Tallarico), Кёнгён Хван (Kyung-Gyun Hwang), Хёк Чхве (Hyook Choi), Гюджан Чо (Gyu-Jang Cho), Чан Ким (Chang Kim), Ильсок Чан (ll-Seok Jang), Чудон Сон (Ju-Dong Song), Эми Квон (Amy M. Kwon)5, Санхо Чон (Sang Ho Jeon), Хёнкён Пак (Hyun-Kyung Park)
Резюме
Фотофункционализация ультрафиолетовым излучением (УФ) останавливает биологическое старение титана за счет трансформации гидрофобной поверхности титановых #имплантатов в супергидрофильную. Формирование кровяного сгустка в области имплантата запускает процесс заживления тканей на границе имплантата с костью. Целью настоящего исследования является сравнение смачиваемости трех типов поверхности имплантата и оценка влияния их характеристик на образование кровяного сгустка. В ходе исследования анализировали три метода обработки поверхности: пескоструйную обработку и травление кислотой (SA); пескоструйную обработку, травление кислотой и облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV); пескоструйную обработку, травление кислотой и нанесение буферного агента рН после облучения вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV + BS). Смачиваемость поверхностей SA + VUV и SA + VUV + BS (n = 5) и образование кровяного сгустка в области имплантатов анализировали с помощью статических и динамических тестов in vitro. Гемостаз оценивали in vivo, сопоставляя процесс свертывания крови в области поверхностей SA, SA + VUV и SA + VUV + BS (n = 4). Анализ с использованием критерия Краскела-Уоллиса выявил статистически значимую разницу между группами (р < 0,05) во всех тестах, за исключением теста на статическое свертывания крови in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что облучение поверхности SA вакуумным ультрафиолетовым излучением придает ей выраженные гидрофильные свойства и является эффективной альтернативой традиционному облучению коротковолновым ультрафиолетовым излучением (УФ-С). Нанесение буферного агента рН на поверхность SA после ее облучения вакуумным УФ увеличивало смачиваемость поверхности и способствовало формированию кровяного сгустка, обеспечивая успешную остеоинтеграцию имплантата.
Цель
Благодаря своим механическим свойствам, биосовместимости и высокой устойчивости к коррозии титан широко используется в стоматологии и ортопедической хирургии. При окислении титана на его поверхности быстро образуется тонкий (1-5 нм) стабильный пассивный слой, защищающий поверхность металла от дальнейшего окисления. По данным исследований, ионы кальция и фосфора из костного матрикса перемещаются внутрь слоя Ti02: этот процесс лежит в основе биологической эффективности титановых имплантатов. Однако с течением времени биологическая эффективность титана снижается из-за неизбежного осаждения углерода из атмосферного воздуха на слое Ti02 в форме углеводорода. Это явление называют биологическим старением титана, поскольку способность титановых поверхностей притягивать белки и остеогенные клетки уменьшается с течением времени. Другим значимым изменением характеристик титановых поверхностей является утрата ими гидрофильных свойств. Непосредственно после обработки угол краевого смачивания титановой поверхности при контакте с водой составляет 0° или менее 5° - такие поверхности называются супергидрофильными 4-7 Через 2 и 4 недели угол краевого смачивания увеличивается до 40° и 60° соответственно, что говорит о превращение гидрофильной поверхности в гидрофобную.
Обработка поверхности имплантата для изменения ее топографии и энергии позволяет увеличить смачиваемость поверхности, усилить пролиферацию и рост клеток, и ускорить остеоинтеграцию имплантата. Существуют аддитивные и субтрактивные методы обработки поверхности. Субтрактивная методика предусматривает удаление слоя материала или придание поверхности большей шероховатости. Примером субтрактивного метода может служить поверхность SA, прошедшая пескоструйную обработку и травление кислотой. Аддитивная методи- ка заключается в нанесении на поверхность других материалов или химических агентов. В качестве примера можно упомянуть плазменное напыление титана, нанесение на поверхность слоя гидроксиапатита, фосфата кальция и других биомиметических покрытий. Формирование остеотомического отверстия для установки имплантата приводит к травме костной ткани, схожей с переломом. В области имплантации развивается гипоксия, внеклеточный рН снижается. В подобных условиях стромальные клетки костного мозга характеризуются пониженной активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) и уменьшением синтеза коллагена, играющих важную роль в формирования костной ткани и остеоинтеграции имплантата. По данным исследований, уровень кислотности влияет на гликолиз и синтез ДНК остеобластов. Внеклеточный ацидоз опосредованно замедляет тромбогенез и агрегацию тромбоцитов (один из ключевых этапов формирования кровяного сгустка), воздействуя на транспорт ионов кальция. Формирование стабильного кровяного сгустка обеспечивает непосредственный контакт между костью и имплантатом и играет важную роль в тромбогенном ответе и остеоинтеграции имплантата. Результаты исследований указывают на наличие взаимосвязи между характеристиками поверхности имплантата и размером фибринового сгустка.
Автора настоящей статьи оценивали характеристики новой поверхности SA, на которую наносили буферный агент рН после облучения вакуумным ультрафиолетом, в ходе предыдущих исследований. Согласно полученным данным, поверхность этого типа характеризовалась более выраженной аффинностью к белкам, клеткам и тромбоцитам, способствуя быстрому и стабильному свертыванию крови, тромбогенезу и остеоинтеграции имплантата. Настоящее исследование направлено на сравнение смачиваемости трех типов поверхности имплантатов и оценку влияния их характеристик на образование кровяного сгустка. В ходе исследования в условиях in vivo и in vitro анализировали три метода обработки поверхности: пескоструйную обработку и травление кислотой (SA); пескоструйную обработку, травление кислотой и облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV); пескоструйную обработку, травление кислотой и нанесение буферного агента рН после облучения вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV + BS).
Материалы и методы
• Подготовка имплантатов
В рамках настоящего исследования использовали имплантаты из коммерчески чистого титана (класс 1V) с тремя типами поверхности: SA, SA + VUV (ТS 111 SA, #Osstem, Сеул, Корея) и SA + VUV + BS (ТS 111 SO1, Osstem). Шероховатость поверхности (Rа) имплантатов составляла 2,5 ± 0,5 мкм (рис. 1а, 1Ь). Фотофункционализацию поверхности проводили с помощью облучения дуговыми ртутными лампами низкого давления, излучающими УФ-С и ВУФ, в УФ-озонаторе в течение одного часа. Для придания поверхности супергидрофильных свойств на нее наносили буферный агент рН, включающий положительно и отрицательно заряженные ионные группы с рКа (показатель константы кислотности) равном 7,31 при температуре 37 °С (рис. 1с).15'16
• Статическая смачиваемость поверхности
Блюдо диаметром 3,5 см заполнили гепаринизированной овечьей кровью на 2-3 см. Имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (по 5 имплантатов каждого типа) погружали в кровь до верхней границы вертикальных канавок. Для оценки скорости смачивания измеряли время, проходящее с момента погружения имплантата в кровь до смачивания кровью его шейки. Измерение временем, необходимого для смачивания всей поверхности имплантата от его апекса, представлялось нецелесообразным из-за наличия вертикальных канавок, разрывающих витки резьбы и препятствующих адсорбции крови.
• Динамическая смачиваемость поверхности
Для имитации установки имплантатов в реальной клинической ситуации в прозрачной акриловой пластине сформировали отверстия с помощью хирургического набора 122 Taper (Osstem) в соответствии с протоколом производителя для твердой кости. В каждое отверстие наливали по 130 мкм дефибринированной овечьей крови, после чего в отверстия погружали имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (по 5 имплантатов каждого типа) с помощью силоизмерительного устройства (MX-500N, lmada Со., Токио, Япония) со скоростью 50 мм/мин. В ходе эксперимента замеряли время, за которое кровь достигала отметок 2 мм и 4 мм относительно края горизонтальной пластины вдоль центральной оси имплантата (рис. 2).
• Статическое свертывание крови
Имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (11,5 мм х 4,5 мм; n = 5) погружали в блюдце диаметром 3,5 см, заполненное 3 мл негепаринизированной овечьей крови. Вес (г) кровяного сгустка на поверхности имплантатов измеряли через 5, 7,5, 10 и 12,5 минут соответственно.
• Динамическое свертывание крови
Тест на активное свертывание крови был разработан для имитации непрерывного поступления крови по капиллярам. Имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (10 мм х 4 мм; n = 5) фиксировали в модифицированной пробирке Эппендорфа с усилием 5 Hсм. Пробирка была подключена к шприцевому насосу, подающему овечью кровь, смешанную с 1 МЕ/мл гепарина при температуре 37 °С. Через 30 минут подачи крови со скоростью 0,05 мл/мин измеряли время (мин) до образования кровяного сгустка вокруг имплантата и объем (мл) крови, которая собиралась в пробирке объемом 15 мл, расположенной под пробиркой Эппендорфа.
• Исследование in vivo
Эксперимент проводили на собаках породы бигль. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике институционального комитета по защите животных и их использованию в экспериментах (CRONEX-IACUC 20191002; Cronex, Хвасон, Южная Корея) в соответствии с принципами "ARRIVE" (исследования на животных: эксперименты in vivo). Четырем самкам собак породы бигль (возраст 18 месяцев) удалили премоляры и первые моляры с обеих сторон нижней челюсти в условиях общей анестезии. Протокол анестезии включал внутримышечную инъекцию 15 мг/кг тилетамина/золазепама (Zoletil 50, Virbac, Сеул, Южная Корея) и 5 мг/кг ксилазина (Rompun, Bayer Korea, Сеул, Южная Корея). После выполнения местной анестезии отслоили полнослойный лоскут в проекции премоляров и моляров нижней челюсти (рис. 3). Зубы разделили на фрагменты, используя обильное водяное охлаждение, с помощью малого фиссурного бора. Зубы удалили с помощью элеваторов и щипцов. Края раны ушили простыми узловыми швами. В послеоперационном периоде назначили антибиотики и обезболивающее; собак кормили мягкой пищей и давали им воду ad libitum.
Через три месяца после удаления зубов собакам установили дентальные имплантаты в стерильных условиях. После выполнения местной анестезии отслаивали полнослойный лоскут для обнажения альвеолярного гребня. Неровный альвеолярный гребень выравнивали. Остеотомические отверстия формировали, используя следующую последовательность сверл: направляющее сверло, спиральное сверло 2,2 мм, коническое сверло 3 мм, коническое сверло 4 мм, коническое сверло 6 мм. Диаметр остеотомического отверстия был больше диаметра имплантата. В общей сложности установили 12 имплантатов SA, SA + VUV и SA + VUV + BS (8,5 мм х 3,5 мм) с усилием 35 Hcm. В зазор между имплантатом и ложем помещали ватный тампон, который пропитывался кровью в течение не более 10 минут. Для оценки процесса образования кровяного сгустка в области имплантата вес (г) ватного тампона измеряли каждую минуту. После хирургического вмешательства животных усыпили с помощью внутривенной инъекции хлорида калия.
• Статистический анализ
Из-за небольшого размера выборки для выявления разницы между группами SA + VUV и SA + VUV + BS in vitro, а также между группами SA, SA + VUV и SA + VUV + BS in vivo использовали критерий Краскелла-Уоллиса (непара- метрический критерий). Разницу считали статистически значимой, если р < 0,05 при α = 0,05. Статистический анализ проводили в программном обеспечении SAS, версия 9.4 (SAS lnc., Кэри, США).
Результаты
• Тесты in vitro
Статическая смачиваемость поверхности Кровь достигала шейки имплантата за 43,3 ± 8,3 минуты и 3,8 ± 0,3 минуты в группах SA + VUV и SA + VUV + BS соответственно. Статистически значимая разница (р < 0,05) между группами была очевидна (рис. 4а).
• Динамическая смачиваемость поверхности
В группе SA + VUV кровь достигала отметки 2 мм и 4 мм над горизонтальной пластиной за 6,4 ± 0,1 мин и 8,5 ± 0,2 мин соответственно. В группе SA + VUV + BS на достижение кровью отметок 2 мм и 4 мм над горизонтальной пластиной уходило 8,5 ± 0,2 мин и 9,3 ± 0,3 мин соответственно. Статистически значимая разница (р < 0,05) между группами SA + VUV и SA + VUV + BS была обнаружена только при сравнении времени, в течении которого кровь достигала отметки 4 мм (рис. 4Ь).
• Статическое свертывание крови
В группе SA + VUV вес кровяного сгустка, сформировавшегося в области имплантата через 5, 7,5, 10 и 12,5 минут, составлял 0,04 ± 0,01 г, 0,09 ± 0,03 г, 0,23 ± 0,06 г и 0,39 ± 0,16 г соответственно. В группе SA + VUV + BS вес кровяного сгустка через аналогичные промежутки времени достигал 0,07 ± 0,03 г, 0,12 ± 0,02 г, 0,39 ± 0,20 г и 0,61± 0,18 г соответственно. Статистически значимая разница между группами SA + VUV и SA + VUV + BS отсутствовала (р > 0,05).
• Динамическое свертывание крови
Для достижения полного гемостаза требовалось 19 ± 0,4 мин и 8,1 ± 1,2 мин в группах SA + VUV и SA + VUV + BS соответственно. Разница между группами была статистически значимой (р < 0,01, рис. 5а). Объем крови, скопив- шейся в пробирке, достигал 8,27 ± 0,36 мл и 3,64 ± 0,99 мл в группах SA + VUV и SA + VUV + BS соответственно: разница между группами была статистически значимой (р < 0,01, рис. 5Ь).
• Эксперимент in vivo
При оценке веса крови, впитавшейся в ватный тампон за 5, 6 и 7 минут, выявили статистически значимую разницу между группами SA, SA + VUV и SA + VUV + BS (р < 0,01, рис. 6). Сводные данные представлены в табл. 1.
Обсуждение
По данным исследований, имплантаты с поверхностью SA способствуют прогнозируемому достижению благоприятных клинических результатов, а поверхность SA является стандартной поверхностью в дентальной имплантоло- гии. Проведенный авторами настоящего исследования статический тест на смачиваемость свидетельствует о супергидрофильных свойствах поверхности после ВУФ-обработки и нанесения буферного агента рН (группа SA + VUV + BS), что подтверждает результаты, полученные в ходе анализа плоских дисков. Поскольку в клинических условиях наиболее важной является способность имплантата притягивать кровь в области шейки (примерно на 4 мм выше горизонтальной пластины в рамках настоящего исследования) был проведен новый тест на динамическую смачиваемость поверхности для более детального сравнения скорости смачивания поверхностей SA + VUV и SA + VUV + BS. Значительно более высокая скорость смачивания поверхности SA + VUV + BS может быть обусловлена только эффектом буферного агента рН, поскольку поверхность SA поставляется сухой. Однако, учитывая, что в реальной клинической ситуации имплантаты устанавливают с сухой поверхностью или без дополнительного увлажнения, в качестве контроля мы использовали «наивную» поверхность SA, а не поверхность SA, увлажненную раствором. Ранее было установлено, что более гидрофильные ассоциируются с более быстрой и качественной остеоинтеграцией имплантата. Кроме того, известно, что смачиваемость поверхности влияет на адгезию белков и других молекул к поверхности, а также взаимодействия клеток. Образование кровяного сгустка сигнализирует о начале процесса заживления, поэтому взаимодействие между поверхностью имплантата и кровью является важным фактором, влияющим на остеоинтеграцию титановых имплантатов. Формирование кровяного сгустка на шероховатой титановой поверхности способствует рекрутированию клеток и стимулирует заживление раны. По данным исследований, преостеобласты и остеобласты прикрепляются к поверхности имплантата, покрытой тромбоцитами и фибрином, и дифференцируются под действием остеогенных факторов и цитокинов, выделяемых из кровяного сгустка в области имплантата. Считается, что образование кровяного сгустка на поверхности имплантата является ключевым фактором, от которого зависит эффективная ретенция фибрина. Кровяной сгусток может оказывать существенное влияние на заживление костной ткани и остеоинтеграцию имплантата за счет воздействия на транспорт макромолекул, поведение клеток и контактный/дистанционный остеогенез. Согласно результатам теста на статическое свертывание крови, поверхность SA + VUV + BS ассоциировалась с более выраженной абсорбцией крови по сравнению с поверхностью SA + VUV, однако разница между группами не была статистически значимой. Полученные данные указывает на то, что поверхность SA, прошедшая только фотофункционализацию ВУФ, оказывает сопоставимое воздействие на свертывание крови. Авторы разработали ряд новых экспериментов для подтверждения гемостаза при капиллярных кровотечениях для максимально точного моделирования реальной клинической ситуаций.
В динамическом тесте на свертывания крови образование кровяных сгустков в условиях in vitro происходило значительно быстрее, а общий объем крови, скапливающейся в зазоре между остеотомическим отверстием и поверхностью имплантата до наступления гемостаза, был значительно меньше в группе SA + VUV + BS по сравнению с группой SA + VUV. Результаты теста in vivo также свидетельствуют о существенной разнице в объеме крови, скапливающейся в зазоре между остеотомическим отверстием и поверхностью имплантата, между группами SA, SA + VUV и SA + VUV + BS. Это говорит о том, что поверхность SA + VUV + BS ускоряет образование кровяного сгустка в области имплантата, способствуя более эффективному взаимодействию между костью и имплантатом в процессе остеоинтеграции. С клинической точки зрения, вышеописанные свойства поверхности SA + VUV + BS улучшают визуализацию хирургического поля и способствуют проведению успешной сопутствующей направленной регенерации кости, направленной на увеличение объема и качества костной ткани для достижения благоприятного эстетического и функционального результата, поскольку быстрое свертывание крови улучшает стабилизацию костного материала и барьерной мембраны.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что обработка поверхности SA вакуумным ультрафиолетовым излучением может быть эффективной альтернативой ВУФ в сочетании с нанесением буферного агента рН, с точки зрения процесса образования кровяного сгустка. Формирование остеотомического отверстия приводит к образованию слабокислой среды, в то же время применение буферного агента рН позволяет поддерживать постоянный рН.38 Покрытие на основе рН-буфера контролирует высвобождение медиаторов воспаления9 и создает оптимальные условия для активности остеобластов15 за счет поддержания постоянного уровня кислотности или, по крайней мере, предотвращения его значительных колебания. Внеклеточный ацидоз ингибирует активность тромбоцитов и остеобластов и снижает выработку щелочной фосфотазы, замедляя формирование костной ткани. Обработка ВУФ и нанесение буферного агента рН на поверхность SA максимизируют активность тромбоцитов, ускоряют тромбогенез, увеличивают активность остеобластов и уровень ЩФ на границе костьимплантат за счет буферного эффекта рН. Для оценки безопасности и эффективности применения имплантатов с поверхностью SA + VUV + BS требуются дальнейшие исследования. Следует также провести рандомизированные контролируемые исследования, чтобы подтвердить целесообразность применения данного типа поверхности в различных клинических ситуациях, например, при немедленной имплантации или установке имплантата в сочетании с костной пластикой.
#стоматология #имплантология #стоматологияхирургия