Криоконсервация ткани яичника и последующая аутотрансплантация — успешный метод сохранения фертильности у онкологических больных. Однако есть опасения относительно безопасности, так как трансплантат может содержать злокачественные клетки. что может привести к повторному возникновению рака. Чтобы обойти эту проблему, предлагается несколько экспериментальных стратегий.
Было включено тридцать одно исследование, охватывающее пять различных экспериментальных стратегии:
1) Созревание ооцитов in vitro;
2) Создание искусственного яичника в качестве каркаса для повторного посева преантральных фолликулов;
3) Стратегия очистки, направленная на уничтожение контаминирующих злокачественных клеток;
4) Созревание ооцитов путем ксенотрансплантации;
5) Оогенез на основе стволовых клеток.
Эти стратегии обхода раковых клеток посредством аутотрансплантации ткани яичника разрабатываются, но до сих пор не дошли до стадии клинических испытаний. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить их риски и эффективность, в то время как этические аспекты, связанные с этими стратегиями, также необходимо обсудить.
Криоконсервация ткани яичника - признаная техника сохранения фертильности, которую можно применить перед лучевой терапией или химиотерапией, особенно для девочек препубертатного возраста и пациентов, которые требуют немедленного лечения и нет времени для созревание ооцитов или эмбрионов
По всему миру более 200 рождений после аутотрансплантации замороженной ткани яичника. Вероятность рождения после трансплантации составляет 26% (Dolmans et al., 2021). Еще одно многоцентровое исследование также сообщает о 41,6% (Shapira et al., 2020)
В связи с этим Американское общество Репродуктивной медицины и Европейское общество репродукции человека и эмбриология заявили, что данная техника прошла экспериментальный этап и теперь должна использоваться в повседневности.
Тем не менее криоконсерваяция ткани яичника по-прежнему сталкивается со многими проблемами в клинической практике, особенно у раковых пациентов.
Замороженная ткань яичника, которая обычно хранится перед началом лечения рака или после фаза индукции, несет риск метостазов (Bastings et al., 2013; Dolmans и др., 2013; Мейроу и др., 2008 г.; Розендаль и др., 2013). После оттаивания и последующей трансплантации ткани яичников эти микрометастазы, могут иметь возможность развиваться в опухоль (эксперементы на мышах) (Dolmans и др., 2010; Shaw et al., 1996). Это указывает на то, что аутотрансплантация замороженно-размороженной ткани яичника может привести к повторному появлению злокачественного новообразования.
Хотя криконсервация, возможно, безопасна в большинстве опухолях, так как поражение может быть ограничено. Вероятность повторного появления рака относительно мало (Dolmans et al., 2021; Gellert et al., 2018), а трансплантации небольшого количества раковых клеток может быть недостаточно, чтобы привести к повторному возникновению злокачественного новообразования (Soares et al., 2015b). Однако даже малейший риск повторного занесения злокачественных клеток остается тревожным сценарием.
Трансплантация замороженно-размороженной ткани яичников у женщин, вылеченных от злокачественных новообразований с высоким риском поражения яичников, следует проводить только в клинике, где имеется большой опыт работы в данном направлении и после тщательного рассмотрения мультидисциплинарной команды. На данный момент необходимо разрабатывать иные стратегии, направленные на устранение злокачественных клеток или предложить альтернативы
Возможное заражение раковыми клетками всегда следует тщательно оценивать перед аутотрансплантацией, используя для обнаружения этих метастазов различные методы. Рекомендовано использовать, по возможности, (иммуно)гистохимию опухолеспецифических маркеров, молекулярный анализ опухолеспецифических транскрипты или ксенотрансплантацию в мышей для подтверждения отсутствия метастатических раковых клеток
Однако, все эти тесты разрушительны для ткани яичника и в конечном итоге не могут быть трансплантированы. Плюс, даже если тестируемый фрагмент обнаруживаются без злокачественных клеток, оставшиеся фрагменты все еще могли таить в себе микрометастазы, из-за этого могут быть систематические ошибки выборки. Это стимулирует разработку новых методов.
Стратегия поиска сформирована в табл. 1
Статьи были отобраны для включения в систематический обзор, если они соответствовали следующим критериям: оригинальные исследования, направленные на безопасное восстановление фертильности у онкологических больных после приема безрецептурных препаратов. Публикации, относящиеся к экспериментам с тканью яичников человека, а также исследования, опубликованные на английском языке и с 1 января 2000 и далее. Крайняя дата 2000 г. была применена, так как в этом году было сообщено о первой аутотрансплантации замороженной-оттаявшей ткани яичника человеку. Таким образом, поиск был ограничен статьями с 1 января 2000 г. по 8 июля 2021 г.
Из всех включенных исследований были извлечены следующие данные: автор публикации, год публикации, источник ткани яичника, дизайн исследования и результаты. Дополнительные собранные данные, такие как начальная стадия фолликулов или стволовых клеток, тип матрицы, методы обнаружения или тесты на жизнеспособность, были извлечены на основе характеристик индивидуальной стратегии.
Результаты
Всего было извлечено 12 722 записи. путем поиска в базе данных, а еще 18 были выявлены в ходе исследований. После удаления дубликатов было проверено 8914 записей по заголовку. Из них 166 полнотекстовых статей были сочтены потенциально подходящими, 31 из которых была включена в качественный синтеза. Включенные исследования, датированные с 2004 по 2021 год. Исследования были сгруппированы в соответствии со стратегией безопасного восстановления фертильности после рака с использованием криоконсервированной ткани яичников. Были определены пять различных экспериментальных стратегий для предотвращения повторного появления злокачественных новообразований: (1) созревание in vitro ооцитов, выделенных из коры яичника, для проведения ЭКО, (2) создание искусственного яичника для повторного засевания преантральных фолликулов, (3) стратегии очистки, направленные на удаление загрязняющих злокачественных клеток из ткани коры яичника, (4) созревание ооцитов путем ксенотрансплантации коры яичника и (5) оогенез на основе стволовых клеток (ФИГУРА 2)
Созревание ооцитов in vitro
Ооциты, созревшие in vitro, потенциально могут быть оплодотворены с помощью ЭКО.
Полученные эмбрионы затем можно пересадить пациенту без риска повторного обсеменения злокачественными клетками, т.к. нет необходимости в аутотрансплантации интактной ткани коры яичника. Созревание ооцитов in vitro (IVM) выполняется на ооцитах, собранных с помощью трех различных процедур: (i) IVM небольших фолликулов, выделенных из фрагментов ткани яичника, (ii) IVM комплексов кумулюс-ооцит из небольших антральных фолликулов или отработанных сред, собранных во время подготовки фрагментов ткани яичника для криоконсервации. (iii) IVM незрелых ооцитов, собранных из небольших антральных фолликулов путем трансвагинального извлечения яйцеклеток. Этот систематический обзор будет посвящен только первому метод, основанный на ооцитах из ткани яичника, полученных при овариэктомии, потому что это метод, который можно использовать для выполнения IVM ооцитов из уже сохраненной криоконсервированной ткани яичника. Было разработано несколько культуральных систем для IVM ооцитов из изолированных фолликулов или фрагментов интактной ткани яичника, иногда с последующей изоляцией фолликулов и выращиванием in vitro для дальнейшего созревания ооцитов (ТАБЛИЦА 2).
Поскольку для разных стадий развития ооцитов требуются разные методы созревания, были разработаны и объединены различные этапы культивирования для получения зрелых ооцитов. Telfer и коллеги сообщили о двухэтапной системе культивирования, показывающей, что однослойные фолликулы человека активируются в фрагментированной свежей кортикальной ткани (Telfer et al., 2008). На втором этапе этой системы культивирования из ткани выделяли вторичные фолликулы. Дополнительное культивирование в присутствии активина А приводило к дальнейшему увеличению размеров вторичных фолликулов.
Другое успешное созревание IVM ооцитов из однослойных фолликулов, был достигнут путем объединения еще большего количества этапов культивирования (McLaughlin et al., 2018). В этой многоступенчатой системе культивирования свежую ткань коры яичника фрагментировали, и примордиальным и первичным фолликулам давали возможность вырасти во вторичные фолликулы, пока они все еще были погружены в ткань коры яичника. Вторичные фолликулы вручную вырезали из ткани, и эти отдельные фолликулы впоследствии культивировали в присутствии активина А и ФСГ. Этот последний этап культивирования в конечном итоге привел к образованию комплексов кумулюс-ооцит, содержащих ооциты метафазы II (MII). Однако эти ооциты продуцировали атипичные большие полярные тельца с соотношением размера ооцита к размеру полярного тельца от 4:1 до 3:1, а степень расширения кумулюса была меньше по сравнению с ооцитами, созревшими in vivo.
Альтернативным подходом к IVM является культивирование изолированных преантральных фолликулов в трехмерных альгинатных матрицах. Матрица обеспечивает преантральные фолликулы физической поддержкой для поддержания их структуры, что приводит к росту фолликулов (Amorim et al., 2009; Xia et al., 2015; Xu et al., 2009) и созреванию ооцитов до стадии MII (Xiao et al., 2015). Рост фолликулов и созревание ооцитов в этих исследованиях также приводили к повышению концентрации 17β-эстрадиола, прогестерона и/или антимюллерова гормона (АМГ) в отработанной среде (Xia et al., 2015; Xiao et al., 2015; Xu и др., 2009; Сюй и др., 2021). Мало того, что производство гормонов в фолликулах возобновилось после эксперимента с IVM, но добавление АМГ в культуральную среду изолированных вторичных фолликулов с последующим истощением АМГ увеличивало продукцию стероидных гормонов и паракринных факторов, что приводило к образованию ооцитов MII. (Сюй и др., 2021).
Однако активацию примордиальных фолликулов можно было наблюдать даже без многоступенчатой системы культивирования, матрикса или гормональной стимуляции. Спонтанная активация фолликула, скорее всего, была связана с нарушением сигнального пути Hippo во время подготовки ткани и последующего культивирования (Fabbri et al., 2012a; Khosravi et al., 2013; Younis et al., 2017). IVM ооцитов из ткани яичников человека посредством спонтанной активации фолликулов, многоэтапных систем культивирования, матриц или гормональной стимуляции еще не привела к получению полных мейотически компетентных ооцитов, которые можно было бы использовать для ЭКО.
Искусственный яичник
Разработка искусственного яичника может служить нескольким целям, включая создание системы поддержки для изолированных фолликулов яичников, лишенных загрязнения злокачественными клетками. Затем искусственный яичник может быть трансплантирован в оставшийся яичник или область малого таза бывшей больной раком или может быть культивирован ex vivo для получения зрелых ооцитов для ЭКО. Эта стратегия основана на изолированных фолликулах и может быть безопасной, поскольку фолликулы яичников инкапсулированы базальной мембраной, которая защищает их от кровеносных капилляров, стромальных клеток и, возможно, также контаминирующих злокачественных клеток. Сам искусственный яичник должен имитировать микросреду коры яичника с достаточной поддержкой и жесткостью, чтобы способствовать росту инкапсулированных фолликулов.
Долманс и его коллеги решили встроить очищенные изолированные фолликулы в сгустки плазмы человека с последующей ксенотрансплантацией мышам. В этой искусственной матрице маленькие фолликулы могли развиваться во вторичные и антральные фолликулы (Dolmans et al., 2007; Dolmans et al., 2008). В исследовании Krotz coworkers тека- и гранулезные клетки из антральных фолликулов были высеяны в микроформованные агарозные гели и образовали трехмерную микроткань (Krotz et al., 2010). Комплексы кумулюс-гранулеза-ооцит, встроенные в микроткань, образовывали большие сфероиды и демонстрировали экструзию полярных телец. Однако, поскольку в исследовании Кроца и его сотрудников использовались ооциты из антральных фолликулов для их трехмерной микроткани, результаты стадии созревания нельзя сравнивать с другими исследованиями с использованием ооцитов из преантральных фолликулов (ТАБЛИЦА 3). В отличие от трехмерной микроткани с агарозными гелями, искусственные яичники, состоящие из альгинатных шариков, не показали выживания примордиальных фолликулов, а поддерживали только рост вторичных фолликулов (Laronda et al., 2014; Инь и др., 2016).
На протяжении многих лет продолжающиеся исследования матриц, состоящих из различных комбинаций фибриногена и тромбина, привели к повышению скорости восстановления фолликулов до 47% (Chiti et al., 2018; Luyckx et al., 2013; Paulini et al., 2016). . Оптимальные концентрации и соотношения фибриноген/тромбин значительно различались между исследованиями. Paulini и сотрудники продемонстрировали 100% жизнеспособность после 7-дневного культивирования в 50 мг/мл фибриногена и 10 МЕ/мл тромбина. (F50/T10) (Паулини и др., 2016). Luyckx и его коллеги, однако, рекомендовали F12.5/T1 и F25/T4 из-за воспроизводимая деградация фибриновой сети, повышенная выживаемость и пролиферация ооцитов, поддержка стромальных клеток и увеличение плотности стромальных клеток (Luyckx et al., 2013). Совсем недавно Чити и его коллеги сообщили, что оптимальными комбинациями фибриногена/тромбина являются F50/T50, поскольку ультраструктура и жесткость этого матрикса больше всего напоминают таковые в коре яичников человека (Chiti et al., 2018).
В дополнение к этим полностью искусственным матрицам также изучалась возможность использования децеллюляризованной ткани коры яичника человека для конструирования искусственного яичника (Pors et al., 2019). После тщательного удаления всех клеточных компонентов, включая возможные контаминирующие злокачественные клетки, этот матрикс может стать более естественным каркасом для изолированных фолликулов по сравнению с искусственно сконструированными сетями. Было показано, что фолликулы, повторно засеянные матригелем, остаются жизнеспособными в децеллюляризованной ткани до 3 недель после ксенотрансплантации (Pors et al., 2019). Хотя есть многообещающие результаты, касающиеся использования искусственного яичника для решения проблемы реинтродукции раковых клеток, более глубокое понимание структуры ткани коры яичника поможет направить дизайн и разработку искусственного яичника, способного поддерживать сложные процессы, связанные с раком.
Стратегии очистки ткани яичников
Обработка ex vivo фрагментов коры яичников или клеточных суспензий для уничтожения загрязняющих злокачественных клеток перед аутотрансплантацией также изучалась как вариант предотвращения повторного появления рака. Эта стратегия, также известная как очистка, основана на использовании специфических ингибиторов или этапов очистки, которые устраняют загрязняющие раковые клетки, но не нарушают функциональную целостность фолликулов яичников или стромальных клеток. Несколько исследовательских групп сосредоточились на чистке как на методе удаления злокачественных клеток из ткани яичника с использованием различных протоколов (ТАБЛИЦА 4).
Одним из подходов к очистке является диссоциация ткани коры яичника для удаления опухолевых клеток из клеточной суспензии (Schröder et al., 2004; Soares et al., 2015a; Soares et al., 2017). Опухолевые клетки рака молочной железы, добавленные к ткани яичника в виде суспензии, в значительной степени, но не полностью, удалялись после очистки активированными человеческими лимфоцитами и биспецифическим антителом BIS-1, в то время как фолликулы оставались морфологически интактными (Schröder et al., 2004). Соарес и его сотрудники установили эффективную очистку, проведя несколько последовательных отмывок фолликулов от суспензий тканей яичников здоровых пациенток, искусственно контаминированных лейкозными клетками (Soares et al., 2015a). Для подтверждения полного очищения эксперимент был повторен с тканью яичников больных лейкемией (Soares et al., 2017). В то время как в эксперименте с искусственно индуцированными лейкозными клетками после промывки фолликулов была обнаружена только одна лейкозная клетка, в суспензии ткани яичника больных лейкемией их не было. Эти подходы к очистке потенциально могут обеспечить изолированные фолликулы, свободные от злокачественных клеток, которые можно было бы инкапсулировать в трансплантируемый искусственный яичник.
В дополнение к очистке суспензий клеток коры яичников, суспензии интактных клеток коры яичников, неповрежденные фрагменты коры яичников могут быть подвергнуты очистке для уничтожения контаминирующих раковых клеток (Diaz-Garcia et al., 2019; Eijkenboom et al., 2021). ; Малдер и др., 2019). В отличие от клеточных суспензий очищенный неповрежденный фрагмент коры яичника может быть непосредственно использован для аутотрансплантации. Корковое вещество яичников, содержащее клетки рабдомиосаркомы или хронического миелоидного лейкоза, эффективно очищалось после 24-часовой инкубации с вертепорфином. Однако клетки саркомы Юинга и рака молочной железы сохранялись в ткани после этого лечения, что указывает на то, что разные злокачественные новообразования требуют разных режимов очистки (Mulder et al., 2019). Было показано, что очистка фрагментов ткани коры яичника с помощью ингибитора киназ Aurora GSK1090716 оказывает пагубное влияние на контаминацию клеток хронического и острого миелоидного лейкоза, вызывая крупномасштабный апоптоз и образование многоядерных синцитиев (Eijkenboom et al., 2021). Было показано, что эти фармакологические методы очистки не влияют на метаболизм ткани яичников, морфологию фолликулов, жизнеспособность фолликулов или рост in vitro. мелких фолликулов во вторичные фолликулы (Eijkenboom et al., 2021). Напротив, было обнаружено, что дексаметазон неспособен эффективно удалять контаминирующие клетки острого лимфоцитарного лейкоза из коры яичников, и лейкозные клетки все еще можно было обнаружить после ксенотрансплантации очищенных фрагментов ткани мышам (Diaz-Garcia et al., 2019). Хотя фармакологическая очистка загрязненных фрагментов коры яичников показывает многообещающие результаты, необходимы длительные эксперименты по ксенотрансплантации, чтобы подтвердить их эффективность и безопасность.
Созревание ооцитов через ксенотрансплантацию
Ксенотрансплант ткани коры яичника можно использовать в качестве источника очищенных зрелых ооцитов, подходящих для ЭКО, тем самым решая проблему передачи раковых клеток через трансплантат (ТАБЛИЦА 5). Многочисленные исследования показали, что ксенотрансплантация ткани яичников от разных видов животных приводит к живому потомству (Dittrich et al., 2015). Для замороженно-размороженной ткани яичников человека сообщалось о развитии ооцитов MII после ксенотрансплантации и стимуляции гонадотропином трансплантированных мышей с последующей IVM аспирированных ооцитов метафазы I, хотя в этих исследованиях был достигнут лишь низкий выход ооцитов MII (ТАБЛИЦА 5) (Kim и др., 2005; Лотц и др., 2014b; Сулеймани и др., 2010). Даже без внешней стимуляции гонадотропинами трансплантаты яичников были способны образовывать вторичные фолликулы у мышей, хотя выход ооцитов MII без гормональной стимуляции у мышей с трансплантатами снова был относительно низкий (Lotz et al., 2014a)
Помимо эффекта гормональной стимуляции фолликулов после ксенотрансплантации, также изучались эффекты использования различных мест трансплантации у мышей. Из этих экспериментов был сделан вывод, что после трансплантации в мышцу спины, получается значительно большее образование ооцитов MII по сравнению с тканью, пересаженной под капсулу почки (17 против 7 ооцитов MII) (Soleimani et al., 2010). Ким и его коллеги изучили структуру с помощью иммуноцитохимической оценки микротрубочек и ДНК ооцитов MII после ксенотрансплантации ткани яичника и показали, что некоторые ооциты демонстрируют аномальное ядерное и цитоплазматическое созревание. Остается неясным, были ли эти аномальные ооциты MII результатом повреждения, полученного в процессе замораживания-оттаивания, или стимуляции гонадотропином и ксенотрансплантации ткани.
Все включенные исследования (ТАБЛИЦА 5) показывают, что ксенотрансплантация ткани яичника человека со стимуляцией гонадотропином или без нее может обеспечить ооциты антрального отдела или MII, хотя и с низкой эффективностью.
Оогенез на основе стволовых клеток
Стволовые клетки являются многообещающими инструментами для улучшения лечения бесплодия у женщин после гонадотоксической терапии из-за их внутренней регенеративной способности. Конечной целью оогенеза на основе стволовых клеток является получение пригодных к оплодотворению ооцитов in vitro непосредственно из стволовых клеток, собранных из ткани яичника (ТАБЛИЦА 6). Parte и коллеги идентифицировали некоторые из клеток, полученных из поверхностного эпителия яичников, как очень маленькие эмбрионоподобные стволовые клетки (VSEL). Эти VSEL были способны к спонтанной дифференцировке в культуре и образовывали ооцитоподобные клетки диаметром 130 мкм с отчетливой блестящей оболочкой и экструзией полярного тельца (Parte et al., 2011). При стимуляции ткани яичника ФСГ или основным фактором роста фибробластов - стволовые клетки яичника также спонтанно дифференцировались в ооцитоподобные клетки с повышенной экспрессией транскриптов генов, специфичных для VSEL, зародышевых стволовых клеток яичника (OGSC) и ранних зародышевых клеток (Parte et al. ., 2013). Повышенная экспрессия маркеров перехода ооцитов и клеток гранулезы (GDF-9, LHX-8 и AMH) свидетельствует о переходе примордиальных фолликулов в первичные фолликулы. Эти исследования показывают, что поверхностный эпителий яичников содержит VSEL, которые могут обеспечить адекватный источник для дальнейших экспериментов по оогенезу на основе стволовых клеток, потенциально предлагая новую стратегию лечения женского бесплодия.
Общий обзор экспериментальных стратегий, приведен в табл. 7
ВЫВОД
Этот обзор подчеркивает большой прогресс в исследованиях, направленных на повышение безопасности восстановления фертильности при онкологических заболеваниях. Разрабатываются несколько стратегий, позволяющих избежать проблемы повторного появления раковых клеток с помощью криоконсервации, но необходимы существенные дополнительные исследования, прежде чем можно будет рассмотреть клиническое применение. Несмотря на то, что эти экспериментальные методики все еще находятся на экспериментальной стадии, они вселяют надежду на будущее. Может пройти несколько лет, прежде чем онкологическая пациентка вернется для аутотрансплантации ткани яичника, которую ее клиницист сохраняет сегодня. Будем надеяться, что к тому времени некоторые из этих стратегий достигнут клинической стадии и предоставят таким женщинам эффективный и безопасный способ восстановления фертильности.