В 1994 году Сенна перешёл из «Макларена» в «Уильямс-Рено», сильнейшую на тот момент команду. Несмотря на завоевание поул-позишн в первых двух гонках сезона — Гран-при Бразилии и Тихого океана, финишировать в них ему не удалось. При этом обе гонки выиграл Михаэль Шумахер на «Бенеттон-Форд», который неожиданно стал главным претендентом на титул. 1 мая 1994 года Айртон участвовал в третьей за свою новую команду гонке — Гран-при Сан-Марино. Он снова выиграл поул, но гонка закончилась для него трагически.
В течение всего уикенда, в который проходила эта гонка, постоянно случались различные неприятности, из которых наиболее серьёзными стали две. Сначала во время пятничных свободных заездов в серьёзную аварию попал Рубенс Баррикелло. Он сломал нос и ребро, оказался в больнице и не смог из-за этого участвовать в гонке. Баррикелло недавно пришёл в Формулу-1 и считался протеже Сенны. Сенна навестил Баррикелло в больнице (врачи запретили ему это делать, поэтому Айртону пришлось перелезть через стену) и после разговора с ним пришёл к выводу, что нужно пересматривать стандарты безопасности в Формуле-1. На следующий день во время субботней квалификации погиб 33-летний австрийский гонщик Роланд Ратценбергер, проводивший всего третий Гран-при в карьере — его машина вылетела с трассы в скоростном вираже «Вильнёв» на скорости около 314 километров в час и ударилась левой стороной о железный ограничитель. Эта смерть шокировала всех, поскольку в течение предыдущих 12 лет никто из гонщиков не погибал на трассе (в 1982 году в Монреале во время Гран-при погиб итальянец Риккардо Палетти, а в 1986 году от отравления угарным газом после аварии на тестах умер другой итальянец Элио де Анджелис) и многие впервые переживали такой момент. Сенна ещё более уверился в том, что необходимо срочно принимать меры по повышению безопасности гонок. Утром, в воскресенье, по инициативе Сенны, состоялось собрание гонщиков, на котором они договорились создать рабочую группу по безопасности, которая занялась бы разработкой плана мероприятий.
На старте гонки болид финна Юрки Ярвилехто заглох и в него, набирая скорость, врезался Педру Лами (при этом разлетевшимися обломками были ранены трое зрителей, один из них тяжело), и на трассу выпустили машину безопасности, чтобы скорость движения болидов снизилась и можно было убрать обломки. Гонщики ехали за машиной безопасности до 6-го круга. На 7-м круге, втором после ухода машины безопасности и рестарта гонки, машина Сенны сорвалась с трассы в повороте «Тамбурелло» и на огромной скорости врезалась в бетонную стену. Согласно показаниям телеметрии, в момент срыва скорость машины была около 310 километров в час, после этого Сенна успел затормозить и замедлить машину, но всё же скорость в момент удара о стену составляла примерно 211 км/ч.
Когда стало понятно, что Сенна остаётся неподвижным в машине, гонка была остановлена, к месту аварии прибыли медики. В этот момент голова Айртона шевельнулась, вселив во многих уверенность, что с Сенной относительно всё в порядке. Но это был лишь мышечный спазм, свидетельствующий о серьёзной травме головного мозга. Подъехавшая бригада медиков увидела страшную картину: неподвижный пилот в разбитой по правый борт машине, из под шлема которого сочится кровь. С трудом сняв шлем профессор Уоткинс (главный врач в F1 на тот момент) провёл тест, который подтвердил серьёзность травмы головы. Из носа сочилась кровь вперемешку с мозговой жидкостью, была разорвана височная артерия и был раздроблен череп над правым глазом. Когда Сенну достали из обломков машины, он практически не подавал признаков жизни, ему сделали трахеостомию. У Айртона был геморрагический шок и большая кровопотеря. В течение десяти минут медицинская бригада пыталась остановить кровотечение и стабилизировать состояние пилота. Затем, прямо с трассы, ввиду большой серьёзности повреждений, минуя медицинский центр, на вертолёте Сенна был доставлен в госпиталь и подключен к аппарату искусственного дыхания.
«Когда Айртон прибыл в госпиталь, я взглянула на него — он был бледен, лицо его было опухшим — но он оставался красивым и умиротворенным. Я заметила глубокую рану над правым глазом, она была трёх-четырёх сантиметров глубиной. Но откуда же столько крови под ним? Когда мы его перевернули, то поняли, что очаг повреждений внутри головы, а кровь сочилась сквозь перелом основания черепа… Было принято решение о проведении электроэнцефалограммы». — врач Мария Тереза Фиандри.
В рукаве комбинезона Сенны был найден испачканный кровью австрийский флаг. По всей видимости, Сенна собирался посвятить свою победу погибшему за день до этого Ратценбергеру, хотя никому не сказал об этом[25]. Остатки машины после судебного разбирательства были возвращены команде «Уильямс» и, согласно её заявлению, уничтожены.
Смерть Сенны стала трагедией для многих болельщиков во всём мире, и в особенности в Бразилии. Бразильское правительство объявило трёхдневный национальный траур. В день похорон Сенны в Сан-Паулу траурную процессию сопровождали несколько миллионов человек. Одним из тех, кто нёс его гроб, был давний соперник Сенны Ален Прост. Сенну похоронили на кладбище Морумби близ Сан-Паулу.