Официально датой основания города считается 15 декабря 1749 г., когда императрица Елизавета Петровна своим указом основала Темерницкую таможню.
По ее указу от 18 августа 1749 г. таможня должна была быть основана в городе Черкасске, но казаки сочли это невозможным для своей коммерческой деятельности, так как имели определенные пошлинные льготы. А на территории таможни эти льготы не действовали.
Императрица, рассмотрев ходатайство, полученное 23 ноября 1749 г., удовлетворила просьбу казаков и обозначила в грамоте от 15 декабря место для таможни в устье Темерника, откуда и взял начало Ростов-на-Дону: «Для сбору тарифов и внутренних пошлин с привозимых из турецкой области и отвозимых из России за границу товаров таможню учредить по реке Дону вверх от устья реки Темерник против урочища, называемого «Богатый колодезь».
Весной 1750 г. в таможне были построены пристань, пакгауз, карантин, гарнизонная казарма.
Здесь в 1756 г. была основана международная «Российская и Константинополь торгующая компания». Темерницкий порт стал единственным русским портом на юге России, через него велась торговля со странами Черного, Эгейского и Средиземного морей.
В 1760-1761 гг. для защиты низовьев Дона от турецких набегов и крымских татарских орд у Богатого колодца началось строительство крепости.
Крепость в форме девятилучевой звезды имела в окружности 3,5 км и располагалась между нынешними переулками Чехова и Крепостным, улицами Горького и Станиславского. Крепость имела два форштадта: Доломановский и Солдатский, которые располагались вдоль берега Дона от нынешнего Доломановского переулка до Ворошиловского проспекта. Внутри располагались 7 продольных и 7 поперечных улиц, а территория была застроена различными зданиями для размещения гарнизона и хранения запасов вооружения. Гарнизон крепости насчитывал более 400 000 человек, еще 1000 проживала в окрестных слободах.
6 апреля 1761 г. указом Елизаветы Петровны крепости было дано имя митрополита Ростовского и Ярославского Димитрия, незадолго до этого причисленного к лику святых Русской православной церковью.
Со временем здесь возвели дома для купечества и духовных лиц, торговые лавки, харчевни, питейные дома, тюрьму и другие строения. Кроме постоянных жителей, на работы в порт регулярно приходило до 3000 человек, выходцев с Украины, селившихся по хуторам и станицам рядом с крепостью. Ростовский порт быстро стал известен в России и за границей, привлекая все больше русских и иностранных купцов. Из Греции и Турции сюда везли вина, сок, апельсины, лимоны, финики, изюм, сушеные фрукты, кофе, жемчуг, сафьян, подзорные трубы, дорогие ткани, предметы роскоши. В обмен вывозились дешевые продукты сельского хозяйства, хлеб, рыба, металл и другие товары.
С историей крепости связаны имена выдающихся русских военачальников. В 1768 г. сюда приезжал адмирал А.Н. Синявин для руководства строительством верфи, в 1783-1784 гг. комендантом крепости был полководец А.В. Суворов, сюда, после нескольких лет службы на Балтике, был переведен адмирал Ф.Ф. Ушаков.
Крепость имела многочисленный гарнизон, была вооружена 238 орудиями и на протяжении полувека использовалась в качестве тыловой базы русских войск. Крепость Святого Димитрия Ростовского сыграла значительную роль в период русско-турецких войн второй половины XVIII века и служила базой для наступления на Азов.
9 марта 1778 г. императрица Екатерина II издала Указ на имя светлейшего князя Г.А. Потемкина, назначенного в 1775 г. правителем Новороссийской, Азовской и Астраханской губерний. Исполнение переселения было возложено на командующего крымской армией А.А. Прозоровского. Но ему не суждено было осуществить этот Указ. Ссылаясь на плохое здоровье, он просит о двухгодичном отпуске. На его место назначается молодой генерал А.В. Суворов. По данным ведомостей Суворова, за август-сентябрь 1778 г. выехало из Крыма 31386 человек, из них: греков ― 18407 душ, армян ― 12598, грузин ― 219, валахов ― 162. В создавшихся условиях переселенцы неоднократно обращались к А.В. Суворову. В конце концов, их прошения увенчались успехом и удовлетворена была их просьба об отводе им земли для поселения в устье Дона близ крепости Димитрия Ростовского. 9 декабря 1779 г. они собрались на отведенной им земле к востоку от крепости Дм. Ростовского, рядом с Полуденным станом, и им была зачитана высочайшая грамота. Новый город получил название «Нахичевань», где обосновались городские жители Крыма, а сельское население ― в окрестностях города, в селах Чалтырь, Топти (Крым), Мец Сала (Большие Салы), Султан Сала и Несвита (Несветай).
9 августа 1797 г. крепость и Нахичевань вошли в состав Ростовского уезда Новороссийской губернии.
К концу XVIII века в связи с присоединением Причерноморья к России крепость утратила свое стратегическое значение, укрепления срыли, а территория крепости отошла к городу. В 1797 г. Ростов становится уездным городом Новороссийской, а с 1802 г. ― Екатеринославской губернии.
После срытия крепостных валов и засыпки рвов город быстро прорезала сеть улиц и переулков, взамен саманных и деревянных стали строить каменные здания, торговая деятельность стала основным занятием жителей. Многоязычная речь, яркие национальные костюмы ростовчан, оживленная жизнь портового города поразили побывавшего здесь в 1820 и 1828 гг. А.С. Пушкина.
В 1835 г. гарнизон и военное имущество Ростовской крепости были переведены в Анапу.
Выгодное географическое положение на перекрестке сухопутных и водных дорог способствовало экономическому развитию Ростова. У его стен образовался торговый порт, принимавший суда русских, греческих, итальянских, турецких, армянских, персидских купцов. В 1887 г. город был включен в состав Области войска Донского, что стало толчком к дальнейшему развитию промышленности. Основой экономики Ростова была торговля, его называли купеческим городом, но к началу XX века в Ростове действовало уже более 100 предприятий, в том числе такие крупные, как Главные мастерские Владикавказской железной дороги, судостроительный, гвоздильно-проволочный, чугунолитейный заводы, две табачные фабрики. Причем каждое третье предприятие принадлежало иностранному капиталу.
Всероссийская октябрьская политическая стачка 1905 г. началась в Ростове забастовкой в Главных мастерских Владикавказской железной дороги 13 октября. Утром 18 октября в Ростове стало известно содержание манифеста, изданного Николаем II, социал-демократы организовали манифестацию рабочих и учащейся молодежи, которая завершилась на площади между тюрьмой и трамвайным депо. Здесь состоялся грандиозный митинг с участием около 10 000 человек с требованием свободы политическим заключенным. На митинге выступили кадеты, социал-демократы, в том числе некоторые из арестованных по подозрению в оппозиционной деятельности и освобожденные во время митинга. Собралась большая толпа черносотенцев с национальными флагами и портретами царя и начала забрасывать митингующих камнями и избивать. Для защиты из рядов митингующих раздались револьверные выстрелы. После разгона митинга казаками толпа черносотенцев бросилась громить еврейские лавки. 19-20 октября еврейский погром продолжался. Хотя по числу убитых (176 человек) и раненых (около 500) он уступил «первое место» одесскому погрому, однако по доле жертв среди еврейского населения, составившей более 1% (в Одессе не более 0,5%), он был самым крупным еврейским погромом начала XX века в России.
Одновременно с Декабрьским вооруженным восстанием в Москве 7-21 декабря 1905 г. в Ростове произошла всеобщая политическая стачка, переросшая в вооруженное восстание.
Во время гражданской войны 1918-1920 гг. Ростов сыграл заметную роль как один из центров Белого движения. В первое формирование Добровольческой армии входил Ростовский добровольческий полк — из учащейся молодежи.
21 апреля (4 мая) 1918 г. Ростов был ненадолго занят другим добровольческим отрядом — полковника М.Г. Дроздовского, пришедшим с Румынского фронта.
10 января 1920 г. в город вошла 1-я Конная армия под командованием С.М. Буденного. Советский период истории Ростова-на-Дону начался 11 февраля 1920 г., когда Белая армия бежала из города.
В конце 1920-х в Ростове-на-Дону началось активное строительство. В 1926 г. был заложен гигант советского сельхозмашиностроения завод «Ростсельмаш». 29 ноября 1935 г. открыт крупнейший в стране драматический театр им. М. Горького со зрительным залом на 2200 мест, где работали известный режиссер Ю.А. Завадский, актеры В.П. Марецкая и Р.Я. Плятт.
28 декабря 1928 г. вышло постановление комиссии ВЦИК СССР «Об объединении городов Ростова и Нахичевани-на-Дону в один город, после чего последний стал Пролетарским районом. Это объединение привело к строительству в Ростове-на-Дону ряда административных зданий. В 1930 г. на площади Нового базара был снесен собор Александра Невского, и в 1929-1934 гг. было построено здание краевого Дома Советов (разрушенное во время Великой Отечественной войны и частично сохранившее исторический облик после реконструкции).
13 сентября 1937 г. постановлением ВЦИК Азово-Черноморский край был разделен на Краснодарский с центром в Краснодаре и Ростовскую область с центром в Ростове-на-Дону.
Немецкие войска занимали город дважды: осенью 1941 г. и летом 1942 г.
В первый раз оккупанты подошли к Ростову 17 ноября 1941 г. Наступление вел 3-й танковый корпус 1-й танковой армии под командованием Э. фон Макензена в составе 13-й и 14-й танковых дивизий, 60-й моторизованной пехотной дивизии и 1-й дивизии СС. Защищали город части 56-й армии РККА, под командованием генерала Ф.Н. Ремезова, в состав которой наряду с другими частями входили 339-я Ростовская стрелковая дивизия и Ростовский стрелковый полк народного ополчения, сформированные из местных жителей.
20 ноября войска вермахта вошли в город. 1-й батальон дивизии СС прорвался к железнодорожному мосту и захватил его невредимым.
Через неделю, 28 ноября, советские войска под командованием маршала С.К. Тимошенко в ходе Ростовской наступательной операции отбили город. Освобождение Ростова стало первой значительной победой Красной Армии в начальный период войны.
Ростов-на-Дону оставался советским до июля 1942 г., когда, после провала наступления Красной Армии под Харьковом, немецкое командование начало наступление на Кубань и Кавказ. 24 июля 1942 г. в Ростов вошла 17-я армия вермахта.
Местом массового уничтожения мирного населения стала Змиевская балка на окраине города, где нацистами было убито 27 000 еврейского населения и 3000 человек других национальностей. Всего нацистами было уничтожено более 40 000 человек, 53 000 ростовчан было угнано в Германию.
Война нанесла городу большой ущерб, Ростов-на-Дону вошел в число десяти наиболее пострадавших от войны городов России.
14 февраля 1943 г. после победы под Сталинградом в ходе общего отступления вермахта на южном участке Восточного фронта, Ростов-на-Дону был окончательно освобожден от немецких войск.
9 августа 1945 г. был утвержден генеральный план восстановления города. А в ноябре ростовчане узнали, что их город включен в число 15 крупнейших и старейших русских городов, подлежащих восстановлению в первую очередь. Ростов-на-Дону начал очень быстро реставрироваться. Восстанавливались и строились новые предприятия. Вместе с ними восстанавливался и сам город. Была благоустроена Городская набережная, которая стала одним из любимых мест отдыха для жителей.
9 мая 1959 г. в Ростове-на-Дону у братской могилы на площади Карла Маркса был зажжен Вечный огонь.
В 1961 г. в состав города была включена станица Александровская, вошедшая в состав Пролетарского района.
В 1963 г. восстановлен Ростовский академический театр драмы им. М. Горького.
В 1965 г. был открыт новый Ворошиловский мост.
В 1969 г. был сооружен Мемориальный комплекс «Павшим воинам» в месте, где в 1943 г. были захоронены 301 человек — советские воины и мирные граждане, павшие в период германской оккупации и в боях при защите и освобождении города.
В 1970-е гг. была проведена реконструкция «Ростсельмаша» и других крупных предприятий города. Во время Великой Отечественной войны 2500 рабочих и служащих завода ушли на борьбу с фашистами в действующую армию и народное ополчение. Свыше 300 комбайностроителей за ратные подвиги были награждены орденами и медалями, 13 рабочих удостоены звания Героя Советского Союза. В ознаменование этих славных подвигов рабочих «Ростсельмаша», в парке им. Н. Островского была установлена Стела Героев. Инициаторами ее создания стали в 1973 г. трудящиеся завода.
6 июля 2010 г. Президент России подписал указ о создании в России вместо 6 военных округов — 4-х объединенных стратегических командований (ОСК). В ОСК «Юг» (Южный военный округ) со штабом в Ростове-на-Дону вошли: Северо-Кавказский военный округ, южная часть Приволжско-Уральского военного округа, Черноморский флот, 4-е командование ВВС и ПВО, Каспийская флотилия.
В 2000 г. Ростов-на-Дону стал центром Южного федерального округа, подтвердив статус крупного регионального центра.
5 мая 2008 г. Ростову-на-Дону присвоено почетное звание «Город воинской славы».