Читая статьи о всяких вирусах, бактериях и микробах вы не раз встречали подобные фразы: грамотрицательные, грамположительные, окраска таким-сяким методом. Что это значит? Разве для наблюдения за всякими микроштучками нужны краски? Нужны, мой друг, но не те, которыми пользуются обычные художники, а анилиновые (полученные окислением анилина). Давайте рассмотрим самые известные методы окрашивания и разберемся в них подробнее, чтобы при прочтении наших статей вас не пугали незнакомые термины.
Микроорганизмы можно исследовать живые, а можно убитые (зафиксированные). Живые исследуют для изучения поведения и жизнедеятельности бактерий, а мертвые для изучения органоидов микроба.
Перед окрашиванием препарат необходимо приготовить: растворить в капле воды на предметном стекле, размазать смесь по стеклышку, подсушить ее и зафиксировать (умертвить). Фиксирование происходит с помощью нагревания, или с помощью химических веществ. Мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые, к тому же фиксация улучшает прилипание клеток к стеклу.
Существуют простые и сложные (дифференцированные) способы окрашивания. В первом случае окрашивается вся клетка и изучается ее форма, взаимоположение с другими микроорганизмами. Во втором окрашиваются отдельные органоиды или структуры несколькими красителями.
При простых методах окрашивания чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Препарат выдерживают в красителе несколько минут, следя за тем, чтобы краситель не подсыхал. По окончании окраски препарат промывают под водой, высушивают, капают на него иммерсионное масло (для усиления яркости и оптического увеличения объекта) и вуаля – готово. Кстати для простого окрашивания используют препараты «раздавленная капля» ( смесь распределяют по стеклу и накрывают покровным стеклышком ), «отпечаток» ( чистое предметное стекло прислоняют вертикально к свежему срезу исследуемого объекта), или «висячая капля» (препарат помещают в лунку в предметном стекле, накрывают покровным и переворачивают).
Существует много видов сложного окрашивания, но мы рассмотри самые известные:
1. МЕТОД ГРАМА
Жил-был такой ученый – Ганс Кристиан Грам – и думая над тем, как проникнуть внутрь клеточной стенки бактерий, придумал необычный способ окрашивания, который на сегодняшний день является самым популярным и полезным методом. Принцип такой окраски заключается в использовании анилиновых красителей (генцианового или метилового фиолетового), и фиксации красителя раствором йода. Промывается окрашенный препарат спиртом. В результате различают грамположительные (Грамм +) бактерии, окрашенные в синий, и грамотрицательные (Грамм -), обесцвеченные в ходе окрашивания. Принцип работы такого метода заключается в том, что в клеточной стенке бактерий есть толстый/тонкий слой пептидогликана, который либо прочно связывается с красителем (толстый слой), либо слабо (тонкий). У бактерий с тонким слоем краситель вымывается при промывке спиртом. Окрасить такие бактерии можно, добавив к ним фуксин – они приобретут красный/розовый цвет.
2. МЕТОД ГИНСИ-БУРИ
На предметном стекле смешивают каплю водного раствора исследуемой культуры и каплю туши. Ребром одного стекла проводят по поверхности другого, высушивают образовавшийся мазок и рассматривают. На темном фоне будут хорошо заметны розовые клетки, окруженные бесцветной капсулой. Этот способ нужен для выявления капсулы у микроорганизмов.
3. МЕТОД ЦИЛЯ-НЕЛЬСОНА
Препарат окрашивают карболовым раствором фуксина через фильтровальную бумагу и подогревают до образования паров. Бумагу снимают, промывают водой, добавляют 5% раствор серной кислоты для обесцвечивания и снова промывают водой. Окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 минут и опять промывают водой. Высушивают и препарат готов. Такой метод используется для определения устойчивости к окислению у бактерий. Некислотоустойчивые обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в синий, а кислотоустойчивые сохраняют красную окраску фуксином.
4. МЕТОД ШЕФЕРРА-ФУЛТОНА
Фиксированный мазок накрывают фильтровальной бумагой с 0,5% малахитового зеленого и нагревают до появления паров. Бумагу снимают, препарат промывают водой и прокрашивают раствором сафалином. Затем снова промывают водой и рассматривают. Метод применяется для обнаружения спор бактерий, они окрашиваются в зеленый цвет, а сами клетки – в красный. Для обнаружения спор также может использоваться метод Ожешко, но так как он сложнее описанного метода, его используют нечасто.
Статья получилась длинной, так что пришло время заканчивать. Существует еще много методик окрашивания, но это мы оставим для второй части (если читателям будет угодно). Учите биологию, и будьте счастливы.