На консолях игра вышла 17 ноября 2009 в США и 15 декабря в России. На ПК вышла 5 марта 2010 года.
Действия будут начинаться с поздней эпохи — Италии 15-го века, периоду, известному в истории как Возрождение. Теперь Дезмонд погрузится не в воспоминания Альтаира, а совершенно другого героя. Этим героем является семнадцатилетний юноша по имени Эцио.
Самое начало стартует с момента, как мы видим еще только младенца. Он же и является наш главный герой. После этой кат-сцены уже виднеется другая картина. А именно драка Эцио Аудиторе в последствии сопровождающаяся бегом. И не в одиночку, а со своим старшем братом, Федерико Аудиторе да Фиренце. После этой ситуации мы можем понять, что характер персонажа — хоть он из богатой семьи, но не высокомерный, а храбрый, достойный, любит родных и готов встать за них горой.
После все этого начинается самое ужасное. Отца Эцио, Джованни Аудиторе, предал его лучший друг Уберто Альберти, и в результате обвинения отец и братья Эцио были повешены. Перед этим Эцио вернулся домой и затем отправился к великому изобретателю и художнику Леонардо да Винчи. Там Леонардо помог ему расшифровать "Кодекс Альтаира" и воссоздал скрытый клинок. Для Эцио потеря части семьи была огромной утратой. И поэтому он убивает предателя своей семьи и скрывается вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио на вилле Аудиторе в Монтериджони.
Позже Эцио узнает, что его семью предала семья Пацци, и он решает поквитаться с ней. Сперва он убивает младшего из этой семьи, Вьери Пацци, потом его отца, Франческо Пацци, а затем старшего из семьи предателей — Якопо Пацци — и его помощников.
Из собрания тамплиеров, в котором непосредственно участвовал Якопо, Эцио узнаёт, что следующие действия тамплиеров будут в Венеции. Приплыв в «город на воде», он сотрудничает с местной гильдией воров. Он убивает двух заговорщиков — Эмилио Барбариго и Карло Гримальди.
Затем Эцио убивает Марко Барбариго, занявшего место прежнего дожа, позднее Эцио убил Сильвио Барбариго и телохранителя Марко Данте Моро, но упускает корабль, на котором те собирались уехать.
Через два года он узнаёт, что скоро возвращается корабль тамплиеров с острова Кипр, и на нём, вероятно, будет одна из частиц Эдема. Следуя за курьером, Эцио лицом к лицу сталкивается с Родриго Борджиа, который убеждён, что он некий пророк. Борджиа удаётся скрыться, зато Эцио узнаёт, что люди, помогавшие ему на всём пути, — ассасины. После нахождения частицы Эдема — яблока Эдема — Эцио отправляется в Романью, где помогает Никколо Макиавелли и Катерине Сфорца защитить их город — Форли.
Однако таинственное яблоко было украдено, и поиски приводят нашего героя обратно во Флоренцию. Воспользовавшись яблоком, бывший монах Джироламо Савонарола захватывает власть во Флоренции. Эцио подрывает его планы, убивая девять помощников Савонаролы по всему городу. Разгневанный народ собирается заживо сжечь «просветителя», но Эцио убивает его прямо на костре.
22 года назад я стоял здесь. И смотрел, как погибают мои родные. Их предали те, кого я звал «друзьями». Месть затмила мой разум. Она погубила бы меня, если бы не мудрость тех, кто научил меня управлять своими инстинктами. Они не давали мне ответов, но помогли мне учиться. Нам не нужны хозяева, ни медичи, ни савонарола. Мы сами вольны выбирать свой путь. Многие хотят отобрать у нас свободу, и многие из вас подчинятся им. Но именно способность выбирать, то что для нас истинно, и делает нас людьми. Ни одна книга, ни один учитель не даст вам ответов, не откроет путь. Выберите свою дорогу, не идите за мной и ни за кем ещё.
P.S. Эцио Аудиторе
После этого Эцио проходит посвящение в ассасины и направляется в Рим, где ему предстоит раз и навсегда разобраться с Родриго Борджиа, который стал Папой Римским Александром VI. Одолев противника, Эцио узнаёт, зачем Родриго стал Папой Римским и зачем он охотился за частицами Эдема. Весь секрет в том, что под Римом покоится «бог», попасть в гробницу которого может только пророк, используя "Яблоко" и "Посох". Пророком оказывается сам Эцио, не знающий о пророчестве. Ведь он просто следовал своей судьбе и в итоге он исполняет его. В гробнице Эцио узнаёт от некой Минервы, что люди были созданы инопланетной расой, которую древние люди принимали за богов, но они давно погибли от загадочной катастрофы, та же участь ждёт Землю, и Дезмонд единственный, кто может помешать этому. После этого Дезмонду в настоящее время приходится бежать из-за того, что их местонахождение нашло "Абстерго". На этом история этой части заканчивается.