Через вирусные векторы ген, кодирующий опсин, может быть интегрирован в нейроны-мишени, что приводит к экспрессии белка опсина на мембране. Близлежащий источник света, установленный на нужной длине волны и частоте, может затем взаимодействовать с ним, активизируя или подавляя нейронную активность.
Введение мутаций к существующим вариантам опсина позволило преодолеть определенные проблемы, связанные с доставкой света. Например, мутант ChR chETA демонстрирует более быстрое закрытие канала и увеличение временного контроля.
Мутант C1V1 может возбуждаться более длинными волнами, что позволяет глубже проникнуть в ткань. В то же время были усовершенствованы и оптимизированы инструменты доставки света для исследований.
Использование оптогенетики в качестве терапевтического инструмента при неврологических расстройствах было исследовано при ЧР, АД и эпилепсии.
Усиленное возбуждение пирамидальных нейронов является общей чертой многих форм эпилепсии, и его контроль может привести к терапевтическому эффекту. NpHR доставки в эти нейроны быстро и резко сократилось припадков при стимуляции света. Повышение тормозной активности интернейронов через трансфекцию возбуждающего опсина ChR также привело к снижению частоты приступов и тяжести при стимуляции светом. Оптическое торможение субталамического ядра в моделях ЧР значительно улучшило акинезию и мелиорацию дискинезии, вызванной леводопой.
Регулирование генной экспрессии
Как упоминалось ранее, точная регуляция экспрессии генов необходима для любого подхода к генной терапии. Хорошая система генной регуляции должна быть регулируемой в широком диапазоне доз; не оказывать никакого нецелевого эффекта; не влиять на экспрессию эндогенных генов; должна быть регионарной или клеточной спецификой; и должна позволять быстро отключать и включать экспрессию трансгена. Регулирование экспрессии генов с точки зрения увеличения или уменьшения уровня конкретного генного продукта или направления информации на желаемую целевую ткань может происходить на разных уровнях. В этом разделе мы обсудим стратегии генной регуляции, используемые в настоящее время в генной терапии, например, на транскрипционном уровне, с помощью тканеспецифичных и индуцибельных промоторов; и на посттранскрипционном уровне - с помощью методов РНК-интерференции.
На уровне транскрипции: Тканеспецифические и индуцибельные промоторы
Регулирование или транскрипция РНК зависит от состояния эвхроматина и гетерохроматина, а также от взаимодействия транскрипционных факторов с регуляторными элементами ДНК, включая промоторы, инсуляторы, усилители и глушители.
Повсеместные и тканеспецифические промоутеры
Промоутеры являются основными элементами, определяющими силу и клеточную специфичность экспрессии генов. Вездесущие и составляющие промоторы сильно активны в широком диапазоне клеток и тканей. Поэтому вездесущие промоторы экспрессии используются в генной терапии, когда таргетирование определенного типа клеток не требуется, т.е. экспрессия трансгена ищется в максимально широком спектре клеток.
Промоторы, часто используемые для неклеточной экспрессии экзогенной ДНК, включают в себя цитомегаловирус (CMV) непосредственно в начале исследования; энхансер/ курица-β актин (CAG); повсеместный С-биквитин человека (UBC); симианский вирус 40 ранних (SV40); коэффициент удлинения человека 1α (EF1α) и фосфоглицерат киназы мыши 1 (PGK).
В предыдущих работах описаны относительные сильные стороны широко используемых транскрипционных регуляторных элементов. КАГ, ЭФ1α и ЦМВ являются самыми сильными из проанализированных. Однако промотор CMV дает переменные результаты, будучи очень сильным в одних типах клеток и довольно слабым в других.
Использование клеточных специфических промоторов может быть полезным для ограничения экспрессии трансгена определенным типом клетки.
Ограничения для их использования в генной терапии включают низкий уровень экспрессии и большой геномный размер. В принципе, специальная маркировка популяции нейронов или глиальных клеток может позволить достичь терапевтической цели, не оказывая на нее нецелевого эффекта. Синапсин-1 (Syn1) и промотор нейрон-специфичной энолазы (НСЭ) используются для селективной экспрессии трансгена в нейронах, в то время как промотор глиального фибриллярно-кислотного белка (GFAP) приводит к астроцит-специфической экспрессии.
Продолжение...