Недавно для преодоления быстрого транскрипционного подавления трансгенов, клонированных вне локуса ICP4, в позвоночник были введены специфические клеточные элементы, препятствующие образованию гетерохроматина на уровне трансгенного промотора. Были оценены различные типы анти-заглушающих элементов, но наиболее эффективным в повышении экспрессии нейронов трансгена как в пробирке, так и в анализах был A2UCOE. В заключение, эти новые репликации-дефектные позвоночники, кажется, обладают особенностями и гибкостью вариантов, необходимых для применения генной терапии в ЦНС.
Ампликоновые векторы являются другим перспективным классом векторов на основе HSV-1. Ампликоны сохраняют все структурные, иммунологические и хозяйские свойства вируса дикого типа, но только два элемента - вирусное происхождение репликации (ori) и последовательность упаковки капсида (pac) - сохраняются из их первоначального генома, другая часть состоит из конкатемерной репликации чужеродной ДНК. Основным преимуществом этого инструмента передачи генов является то, что тотальная делеция вирусных генов позволяет вставить до 150 кб экзогенной ДНК.
- Количество конкатамерных повторов зависит от размера кассеты экспрессии, т.е. короткие последовательности позволяют вставить больше копий интересующего гена. Кроме того, полное отсутствие всех вирусных генов сильно снижает риск реактивации, комплементации или рекомбинации с латентными генами HSV-1.
Недостатком является то, что ампликоновое размножение довольно затруднено, так как отсутствуют клеточные линии, способные дополнить все вирусные белки в транс. Поэтому первое поколение ампликоновых векторов размножалось путем трансфекции ампликоновых плазмид в клетки, которые затем были суперинфицированы хелперным вирусом HSV-1. К сожалению, такой подход приводит к значительному (около 1%) заражению хелперовым вирусом.
Многообещающей альтернативой является использование хелперового вируса LaL, в котором последовательность упаковки может быть удалена путем рекомбинации конкретного участка Cre-lox, снижая загрязнение хелперов до 0,05-0,5%.
Несмотря на то, что ампликоновые векторы широко использовались для изучения механизмов функционирования ЦНС, лишь в немногих исследованиях основное внимание уделялось их использованию для генной терапии. В последнее время ультрачистые ампликоны, произведенные с использованием высокодефектного хелпер-вируса, были использованы, чтобы заставить замолчать выражение нейротрофического фактора (BDNF), полученного мозгом, в животной модели эпилепсии.
Помимо производственных трудностей, ампликоновые векторы страдают от относительно кратковременной экспрессии трансгенов в живом организме. Скорее всего, присутствие бактериальных последовательностей в геноме ампликона приводит к глушению трансгена путем образования неактивного хроматина. Поэтому современные исследования в этой области сосредоточены на разработке новых, хелперово-независимых технологий производства вирусов и средств получения долговременной экспрессии трансгена.
Доставка генов
Гены кодирующие терапевтические белки
Вопрос, который возникает вместе с разработкой подходящих векторов для переноса генов в ЦНС, заключается в том, какие гены передать. Первый, наиболее очевидный вариант - это гены, кодирующие терапевтический белок.
- Это может быть правильная копия дефектного гена, неисправность которого вызывает заболевание, но также ген, кодирующий терапевтический белок, который не может быть введен периферически, не в состоянии пересечь BBB.
В этом последнем случае белок может быть диффундирующим (т.е. производимым и секретируемым инфицированной клеткой) для создания побочного эффекта в соседних клетках.
Однако, помимо генов, кодирующих терапевтические белки, существуют и другие варианты груза для векторов генной терапии ЦНС, такие как генное редактирование, хемогенетические и оптогенетические средства.
Инструменты редактирования генов
Шаг вперед был сделан в области генной терапии с разработкой инструментов генного редактирования, которые могут исправлять генетические дефекты непосредственно в ДНК хозяина. Эти инструменты генерируют двойной перелом (DSB) в точно желаемом месте, и этот перелом позволяет воспользоваться преимуществами тонких стратегий, которые клетки развились для обнаружения и исправления повреждений ДНК. DSB может привести к разрушению гена не гомологичным конечным суставом, или добавлению или восстановлению гена путем гомологичной рекомбинации с использованием экзогенного шаблона восстановления. Наиболее перспективной системой генного редактирования является система Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas (CRISPR/Cas). Платформы доставки, описанные в данном обзоре, безусловно, необходимы для этого нового и мощного терапевтического инструмента.
Продолжение...